大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子包涵体的复性与纯化文档资料.ppt
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1、基因工程操作:基因扩增、表达;原核细胞;包涵体的形成与特点。重组蛋白分离纯化:细胞收集、破碎;包涵体的溶解;蛋白质变性、复性:稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法;蛋白质构象的表征:包涵体构象变化、圆二色谱法,实验技能训练要点,主要新知识,仪器分析:色谱技术 液相色谱技术仪器分析:光谱技术-荧光光谱、核磁共振 化学生物学导论:蛋白质、酶蛋白质与酶化学:重组DNA技术蛋白质纯化与表征:液相色谱法、蛋白质构象表征.有机化学:荧光探针,实验技能训练要点,主要知识回顾,背景知识,实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品,包括以下步骤:目的基因DNA片段的获得;E.
2、coli 重组表达载体的构建;在E.coli 中对目的基因进行表达;目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化;规模化生产工艺(包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等)的建立。,关键词:重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor,Renaturation and purification by liquid chromatography,实例:粒细胞白血病,人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用,HSC,CLP,CMP,GMP,MEP,Pro-T,Pro-B,T,B,NK,单核细胞
3、,粒细胞,巨核细胞,红细胞,SCF;IL-2,SCFEPO,SCF,SCF,SCF,SCF,IFN-,SCF,基质细胞,SCF,rhG-CSF的理化性能与生物学功能,几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较,西北大学化学与材料科学学院,实验内容提要,一、实验目的,掌握包涵体的变性、复性的基本原理;熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法;熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。,通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5中重组包涵体蛋白表达、复性的实验,使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系;,基因工程技术是指人们按照自己的愿望
4、,通过体外DNA重组和转移等技术,有目的地改造生物物种,使现有物种出现人类需要的性状的技术;以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术,使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。,二、实验原理-基因工程技术,大肠杆菌中高效表达的蛋白,常常以不可溶解包涵体存在;包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物,其一级结构(即氨基酸序列)是正确的,立体结构是错误,所以没有生物活性;包涵体能够溶解于强的变性剂,如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。,二、实验原理包涵体的形成和特点,直接稀释法(Direct dilution),包括透析法和超滤法液相
5、色谱复性法(Chromatographic methods for protein refolding)人工配基辅助的蛋白复性(Artificial molecular chaperone assisted protein refolding),二、实验原理体外复性的主要途径,液相色谱复性蛋白的过程,蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在,从而实现单个分子相互分离,并抑制聚集产生,合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。,西北大学化学与材料科学学院,三、实验试剂和仪器,尿素(成都金山化学试剂厂),乙腈(色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司);三氟醋酸(分析纯,Fluka公司);硫酸铵、氢氧化钠、
6、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯(西安化学试剂厂)。-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)均购自Sigma公司(St.Louse,MO,美国)。,试剂,三、实验试剂和仪器,纯水仪,离心机,二氧化碳培养箱,快速蛋白纯化仪,日立F-4500荧光光谱仪,仪器,环节1,环节2,环节3,四、实验步骤与方法实验天数,四、实验步骤与方法,四、实验步骤与方法-流动相组成,普通SEC:0.15 mol/L NaCl,3.0 mol/L urea,0.05 mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA+1.0 mmol/L,pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG,15%甘油;脲梯度SEC:A
7、为 0.05 mol/L Tris(pH 8.0),1.0 m mol/L EDTA,0.15 mol/L NaCl,2.5 mmol/L GSH+0.8 mmol/L;B为 8.0 mol/L urea。,1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化,流动相平衡Superdex 75(16/20)柱子,然后将200 L 8.0 mol/L脲溶解变性的rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中,用平衡时所用的流动相洗脱复性的rhG-CSF。流速1.0 4.0 mL/min,检测波长为280 nm。收集复性的rhG-CSF馏分,测定蛋白浓度。将收集液用稀盐酸将其pH调至4.0,然后对储存液10.0
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