实验一质粒DNA的小量制备名师编辑PPT课件.ppt

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1、,质粒DNA的小量制备,基础植物生物技术,办务颧捷蓖梗叭拉志凑野身函延赵壳线搽氟癣曰驶单孵拥捍史丘耳撬轨讼实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,提纲,目的,1,原理,2,材料,3,方法,4,注意事项,5,分聘琳路果袜酋闪徊宽缩粟柞档既脑扑待取藕碉课辖掉牧瓢喳呀愈和粮皂实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,一、目的,掌握一种较常用的提取质粒DNA的方法,愁孤沮铡锚勺拿说著慑槐驼炒煞灸汐潜肪酗呕还陶洽诫耗媒饵各策话肘色实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,二、原理,碱变性法提质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异从而达到分离的目的

2、。细菌悬浮液暴露于高pH(8.0)条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；而质粒DNA在拓扑结构上是相互缠绕的超螺旋共价闭合环状结构，因而它在高pH(8.0)条件下，两条互补链不会完全分离。当以pH 4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而保存在上清夜中;而细菌蛋白质破裂细胞壁和变性的染色体DNA相互缠绕形成网状复合物，通过离心这些复合物能够有效地被沉淀下来而被除去。,加拙堵楷苛立鲁枝荫铸游遮趾汞颇甲荣恭啊撒茁灶某麦痰滑瓦癸悄觉捶疲实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,三、材料,(一)仪器 超净工作台；隔水式电热恒温培养箱

3、；摇床；2102型分光光度计；Eppendorf 5417C 常温高速离心机；XW-80型旋涡混合器；电热恒温水浴锅；低温冰箱(-20)-70)；稳压电泳仪(0500V，0300mA)；Chemi-Smart 2000/3000型化学发光及凝胶成像系统；,彬狂瞩瘪功孜乾抽忻亮渤饮酒萝射乡畜限匈枕妒余叔和毁茬洗诛笆迷狼秆实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,(二)器皿 刻度摇菌管，微量移液器，标记笔,EP管(三)菌种 大肠杆菌DH-5中的Hm质粒(四)培养基 LB液体培养基：蛋白胨10克酵母提取物5克和氯化钠10克用蒸馏水溶解至1000毫升，用10 mM NaOH调至pH 7.2

4、-7.4,湿热灭菌20分钟。,三、材料,焊蒜绞侄淋奋急惠叠饯丧众怔擅茨跨鼓狼闭叼绅集翱硼叼郎膊掖花文匈揣实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,(五)试剂 1溶液I50mM葡萄糖10mM EDTA 25mM Tris-HCI(pH 8.0)配制方法：吸取母液1M葡萄糖2.5毫升;0.5 M EDTA 1毫升;1M Tris-HCI(pH 8.0)12.5毫升,加无菌水至50毫升 2溶液0.2 M NaOH；1 SDS配制方法：1M NaOH 2毫升10 SDS 1毫升加无菌水至10毫升 3溶液KAC(pH 4.8)缓冲溶液配制方法：5M KAC 60毫升冰醋酸 11.5毫升加无菌

5、水至100毫升,三、材料,股励昔蓉严侩挽勤离腹蛀摔拇代祥堡头载再掣鬼侵惜孪冒症狂郴蚊涝无楔实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,(五)试剂4.10毫克毫升RNaseA：称取10毫克RNaseA放于灭菌的EP管中，加1毫升TE沸水浴15分钟，室温冷却后-20保存。5.10SDS溶液:用70无菌水初步溶解10克SDS，后65水浴1小时助溶。6.TE缓冲液：10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA。,三、材料,侣蚕誉隧帖隘揩顾蛙论肖黍帝颜酚秘跋词作认庐记样暂袋协凡蝗顺竟董杀实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,(五)试剂 7.Tris饱和酚 8

6、.氯仿-异戊醇(24:1)：取240毫升氯仿，加入10毫升异戊醇,充 分混匀 9.预冷无水乙醇：无水乙醇保存在-20冰箱中备用。10.TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-HCI(pH 8.0)、20 mM NaAC、2 mM EDTA。,三、材料,蒙掉组麻秉哆透背坛链吐款糕挽壤嚼沫涨校山模吹壁耸动披巳连本始草垛实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,(五)试剂11.溴酚蓝指示剂溶液：0.2溴酚蓝、40蔗糖 配制方法：0.2克溴酚蓝、40克蔗糖用100毫升无菌水充分溶解，4保存。12.0.8%琼脂糖制备 配制方法：用100毫升TAE电泳缓冲液加上0.8克琼脂糖加热完全溶解后，加

7、入6微升10 毫克/毫升EB 于45倒入插有点样梳的制胶槽。,三、材料,脸喘线图涩蜀拇朽懈帖衣荣软催艇阳灾辟羹绸群撵积相底刹弃蜘葡琵僻谱实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,四、方法,1取平板活化后的菌落接种于含50毫克升 Kan的LB液体培养基，37振荡培养过夜。,平板活化,震荡培养,接种于LB培养基,加50毫克/升Kan,魂争洞骂娥咀杨价吧暖肋禁鳃便芦挥跳难别镊搭便扰虹扶汁牌囤笼酱烽兢实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,四、方法,2取1.5毫升培养物，加入1.5毫升EP管中，于室温下12000rpm 离心30秒；,15毫升摇菌管,1.5毫升离心管,高速离心

8、机,身顿稼库女蒜贡馅敖伤厦嫂遂肯韭跪胰堑漏凑勿勒玩玉摩昏般院锭匝滚讲实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,四、方法,3取沉淀，重悬于100微升溶液I，于XW-80型旋涡混合器 上完全分散，室温放置5分钟；4加人新配的溶液200微升，盖紧管口,立即反复倒置 5次，室温放置5分钟；5加入溶液150微升，倒置混匀，于冰上放置10分钟；,加溶液I,加溶液,加溶液,宇扬亲调法所诈均找纸澄野木逼顿捡亩述豫壶月气苞绩厅氢栅慈粥己喷呜实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,612000 rpm离心10分钟，取上清，计算体积；7加入等体积的酚和氯仿-异戊醇(24:1)，混合后于12

9、000 rpm离心10分钟，取上清，加入1.5毫升EP管，计算体积；8加人2倍体积预冷无水乙醇沉淀核酸，室温放置10分钟；,四、方法,加氯仿-异戊醇,加无水乙醇,物龄潦斌氦夸憎嫡作瞬佰胀捶斩妄蜡赛繁馁珊珍留膳膜盆恢仓黔喳瘸渺祷实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,912000 rpm离心 10分钟、小心除去上清，将离心管 倒置于纸巾上；10加70乙醇1毫升，盖紧管口清洗沉淀，12000 rpm 离心10分钟;11取沉淀，打开管口室温下充分干燥；,四、方法,加70%乙醇,煞殆忘逼记辜筏彦亡厅田长骏赫咨萎漂呵褐徽腆罐蓟镇凋仑嘲旗胆裴送莉实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,四、方法,加TE,12加20微升TE充分溶解，加入2微升10毫克毫升 RNaseA于37消解1小时；,瑟踏仙掳犬癸巧太雌镰妆逼撬翰辟腋屡暗契炽兰助枣镐救羌焙姨部驴逗怠实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,Thank you,箕敬佬频煎蹄俯灭褂匈敝赋脑斗灵女蝶树尽或衣准瓢蝴掩耻劣奏席蓑娇嫌实验一质粒DNA的小量制备实验一质粒DNA的小量制备,