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1、2023/4/29,1,本章内容,第一节 标本的采集和处理原则第二节 细菌的形态学检查第三节 细菌的分离培养和鉴定第四节 细菌的非培养检测方法,2023/4/29,2,第一节 标本的采集和处理原则,一、标本采集的一般原则1早期采集 2无菌操作 3根据目的菌的特性用不同的方法采集4采集量适当 5注意生物安全,2023/4/29,3,第一节 标本的采集和处理原则,二、标本的处理1.对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检2.其他各种标本采集后最好在2h之内送到实验室3.若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存4.一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h

2、,2023/4/29,4,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出.对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送,2023/4/29,5,药物敏感试验,直接涂片镜检,分离培养,形态学试验生化试验免疫学试验动物试验,明确诊断,初步诊断,免疫学试验分子生物学技术其他检测技术,细菌感染的检验程序,辅助诊断,2023/4/29,6,第二节 细菌的形态学检查,1.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量2.通过形态学检查可得到初步诊断

3、，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，用于细菌鉴定,细菌形态学检查的意义,2023/4/29,7,不染色标本的检查：初步观察、细菌动力单染色法：细菌形态复染色法：细菌形态、结构与鉴别 革兰染色法（Gram stain）抗酸染色法（acid-fast stain）特殊染色法：负染色、鞭毛染色,细菌的形态学检查法,2023/4/29,8,一、不染色标本,1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况2.常用的方法有压滴法和悬滴法 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显 的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动

4、，只在原地颤动而无 位置的改变3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定 如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,2023/4/29,9,二、染色标本,（一）常用染料1碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等2酸性染料：有伊红、刚果红等3复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料有荧光标记的抗体,2023/4/29,10,（二）常用的染色方法,1革兰染色（gram stain）方法：1、结晶紫初染 1 min 2、卢戈氏碘液媒染 1 min 3、95酒精脱色 30sec

5、1 min 4、稀释石炭酸复红复染 1 min原理：G+等电点低，带正电荷的碱性燃料作色牢固G+细胞壁肽聚糖层多，G-细胞壁脂质含量高G+含有较多核糖核酸镁盐，与结晶紫、碘结合成大分子复合物意义：鉴定细菌与致病性有关选择抗菌药物参考,革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌,2023/4/29,11,（二）常用的染色方法,2抗酸染色（acid-fast stain）方法：1、石炭酸复红初染加热35min，水洗2、3%5%盐酸酒精脱色30s，水洗3、碱性美蓝复染30s，水洗。原理：分枝杆菌属的细菌，胞壁脂质多，其中的分枝菌酸与石炭酸复红结合成牢固的复合物，能抵抗脱色意义：可将细菌分为两大类：-抗酸性细菌-非抗

6、酸性细菌,2023/4/29,12,（二）常用的染色方法,3荧光染色（1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。（2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。4.鞭毛染色：可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。5.异染颗粒染色：用于白喉棒状杆菌染色。,2023/4/29,13,（二）常用的染色方法,6.芽胞染色：,7.墨汁染色:一般用于新型隐球菌检查,2023/4/29,14,第三节 细菌的分离培养和鉴定,选择培养基,接种,选择培养方法,选择可疑菌落,选择鉴定方法,2023/4

7、/29,15,细菌的分离培养和鉴定,一、培养基的种类和选择 培养基的组成成分、培养基种类、培养基的选择二、分离及培养 细菌的分离、细菌培养方法三、生化反应和鉴定 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验,2023/4/29,16,一、培养基的种类和选择,培养基（culture medium）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。,2023/4/29,17,(一)培养基的组成成分,1营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子2凝固物质 琼脂、明胶、卵白3抑制剂和指示剂,2023/4/29,18,（二）培

8、养基种类-按成分和培养目的,1基础培养基（based medium）2营养培养基（nutrient medium）3鉴别培养基（differential medium）4选择培养基（selective medium）5特殊培养基（special medium）,2023/4/29,19,1基础培养基,含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。用于培养一般细菌,2023/4/29,20,2营养培养基（nutrient medium）,最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等，用于培养营养要求较高的病原性细菌,2023/4/29,21,3鉴别

9、培养基（differential medium）,在培养基中加入特定底物和指示剂，观察细菌不同的代谢产物，以鉴别细菌。如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。,2023/4/29,22,4选择培养基（selective medium）,在培养基中加入抑制剂抑制杂菌，以利目的细菌生长，如SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到,2023/4/29,23,5特殊培养基（special medium）,疱肉培养基用于培养厌氧菌巯基乙醇酸纳培养基用于培养细菌L型,2023/4/29,24,（二）培养基种类-按物理性状,液体培养基：增菌、制备产物、生化反

10、应等固体培养基:琼脂平板:分离培养 琼脂斜面:菌种短期保存、生化反应等半固体培养基:动力试验、菌种长期保存、生化反应等,2023/4/29,25,（三）培养基的选择,目的病原菌：伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌，血平板用于分离病原性球菌。,标本来源：从血液、骨髓中分离病原菌先用血液肉汤增菌，粪便标本分离培养肠道病原菌用SS琼脂，,2023/4/29,26,二、分离及培养,1平板划线分离法2斜面接种法3液体接种法,（一）细菌的接种,4穿刺接种法5倾注平板法6涂布接种法,2023/4/29,27,（二）细菌培养方法,1一般（需氧）培养法：普通温箱 2二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 3厌

11、氧培养法：厌氧袋/罐（化学）法、厌氧培养箱（物理学法）、疱肉培养基（生物学）法,2023/4/29,28,固体培养基中,菌落（S型）,菌苔,菌落（R型）,细菌的生长情况,2023/4/29,29,沉淀生长,混浊生长,表面生长,液体培养基中,2023/4/29,30,混浊生长,沿穿刺线生长生长,有鞭毛细菌,无鞭毛细菌,半固体体培养基中,2023/4/29,31,三、生化反应和鉴定,（一）碳水化合物的代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验 是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要,2023/4/29,32,2氧化发酵试验（O/F试验）,主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前

12、者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,2023/4/29,33,3半乳糖苷酶试验（ONPG试验）,迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,2023/4/29,34,三、生化反应和鉴定,4七叶苷水解试验 主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。5甲基红试验 主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。6VP试验 本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的 细菌，后者通常为阴性。,2023/4/29,35,（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验,2吲哚(靛基质)试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,1.

13、明胶液化试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。,3硫化氢试验培养基：醋酸铅培养基 应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别,2023/4/29,36,三、生化反应和鉴定,4尿素分解试验 主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。5苯丙氨酸脱氨酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。6氨基酸脱羧酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,2023/4/29,37,（三）碳源和氮源利用试验,1枸橼酸盐利用试验 用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。2丙二酸盐利用试验 肠杆菌科中属间及种的鉴别。,2023/4/29,38,（四）各种酶类试验,1氧化酶试验主

14、要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。2过氧化氢酶试验（触酶试验）用于革兰阳性球菌的初步分群。,2023/4/29,39,3硝酸盐还原试验,本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。,2023/4/29,40,三、生化反应和鉴定,4脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴别。5卵磷脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴定。6 DNA酶试验 在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌产生此酶。,2023/4/29,41,三、生化反应和鉴定,8 CAMP试验 在链球菌中，只有B

15、群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。,7 凝固酶试验作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,2023/4/29,42,（五）抑菌试验,1 O/129抑菌试验 用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。2杆菌肽试验用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。3奥普托欣（Optochin）试验主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。,2023/4/29,43,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学技术 抗原检测、抗体检测二、分子生物学技术 核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术三、细菌毒素的检测 内毒素、外毒素四、动物实验,2023/

16、4/29,44,一、免疫学技术,概念辨析,免疫学检测免疫学诊断免疫学反应免疫学技术,血清学检测血清学反应血清学技术,血清学诊断,抗原 不区分 抗体,2023/4/29,45,（一）细菌Ag检测,菌体Ag：IFA、荧光菌球法、凝集试验游离Ag：ELISA,免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。,血清学试验的对照设计+/0？,2023/4/29,46,（二）抗体检测-血清学诊断,抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的升高。因此用已知的细菌

17、或其特异性抗原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。,2023/4/29,47,标本：双份血清标本，恢复期比急性期血清标本抗体效价升高4倍方有意义,方法,原理：用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。,凝集试验：,沉淀试验：,补体结合试验：,中和试验：,肥达试验、外斐试验,梅毒VDRL、RPR试验等,抗链“O”试验等,Q热柯克斯体抗体检测等,细菌的血清学诊断,2023/4/29,48,二、分子生物学技术,（一）核酸杂交 DNA可进行变性、复性、杂

18、交。利用这一特性，制备特定序列DNA片段，进行标记后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与标本中已变性的细菌DNA进行杂交，通过检测杂交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。,探针的种类：克隆片段DNA探针、寡核苷酸针、质粒DNA探针、rRNA探针、,2023/4/29,49,（一）核酸杂交,2核酸杂交在临床细菌检测中的应用（1）细菌分类鉴定（2）细菌快速鉴定（3）细菌耐药性的检测（4）细菌毒素的检测（5）细菌流行病学调查,2023/4/29,50,（二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,1.特异性DNA体外扩增技术2.

19、特异、灵敏、快速、操作简便3.广泛应用于细菌的鉴定PCR在临床细菌检测中的应用1.细菌的快速检测 2.细菌毒素的检测 3.细菌耐药性的检测 4.细菌流行病学调查,2023/4/29,51,（三）生物芯片技术,1.通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统。2.对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组的准确、快速、大信息量的检测。3.常用的生物芯片分为二大类：即基因芯片和蛋白芯片。,2023/4/29,52,三、细菌毒素的检测,（一）内毒素内毒素的测定，主要用于确诊病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。方法：鲎试验。,2023/4/2

20、9,53,三、细菌毒素的检测,（二）外毒素 外毒素的测定可用于待检菌的鉴定，同时可区分产毒株与非产毒株。方法：1.体内毒力试验：动物试验，如破伤风毒素试验 2.体外毒力试验：Ag-Ab反应，如ELEK平板毒力测定,2023/4/29,54,其他成分检测,酶试验：脲酶(HP)、血浆凝固酶试验(葡萄球菌)、自溶酶(肺炎球菌)等毒素检测：溶血毒素(链球菌)、肠毒素(葡萄球菌)、神经毒素(肉毒杆菌)等特殊成分检测：真菌多糖，细菌LPS、胞壁酸、吡啶二羧酸(DAP芽抱)、分枝菌酸（分枝杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属和红球菌属）等,2023/4/29,55,四、动物实验,1.用途：（1）分离和鉴定病原微生

21、物（2）测定细菌的毒力（3）制备免疫血清（4）建立致病动物模型（5）动物的血液是配制细菌培养基必须的实验材料（6）用于生物制品或一些药物的安全、毒性、疗效检验2.常用的接种方法：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射和脑内注射等。,2023/4/29,56,复习要点,概念：病原学诊断、血清学诊断、分离培养、细菌鉴定、细菌生化反应、药物敏感试验、K-B法、E-test、MIC、细胞培养、血细胞吸附、FIA、细菌学检查的基本程序细菌学检查标本采集的基本原则细菌学检查常用方法（基本原理、操作程序和结果解释）常见生化反应的基本原理,2023/4/29,57,复习思考题,细菌学检查所用标本采集的基本原则是什么？细菌学检查的基本策略有哪些？如何选择？细菌学检查的基本方法有哪些？其基本原理是什么？细菌与真菌和病毒性疾病相比，其实验诊断策略和方法有何特点？为什么？细菌学检查常用方法有哪些？,2023/4/29,58,课外阅读书目,Hawley LB，微生物与感染性疾病，中信出版社，2004闻玉梅，现代医学微生物学，上海医科大学出版社，1999Brooks GF，Medical Microbiology，人民卫生出版社，2001蔡文成,实用临床微生物诊断学，东南大学出版社，1998,