第16章 细胞因子与黏附分子检测文档资料.pptx

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1、第十六章 细胞因子与黏附分子检测,郑晓群,目 录,第一节 概述第二节 临床常用的测定方法第三节 细胞因子与黏附分子测定的临床应用,第一节 概述,重点提示,细胞因子与黏附分子概念细胞因子的作用特点细胞因子的生物学功能黏附分子的生物学功能,概念,细胞因子（cytokine）是由免疫细胞及组织细胞表达并分泌的，在细胞间发挥相互调控作用的一类小分子蛋白质或多肽，通过与细胞表面相应受体的结合发挥生物学效应。,概念,黏附分子（adhesion molecules，AM）是由细胞产生、介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互结合的分子，以受体-配体结合的形式发挥作用。,一、细胞因子及其受体的特性与功能,白细胞介素

2、（interleukin，IL）干扰素（interferon，IFN）集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）生长因子（growth factor，GF)趋化因子（chemokine）,细胞因子的种类,一、细胞因子及其受体的特性与功能,低分子量的多肽或糖蛋白，大部分为单体，半衰期短。具有高效性、多效性、重叠性、网络性、协同性和拮抗性。,细胞因子的特性,一、细胞因子及其受体的特性与功能,参与调控免疫细胞的发育、分化和功能。参与调控机体的免疫应答。参与体内免疫调节网络等作用。,细胞因子生物学功能,一

3、、细胞因子及其受体的特性与功能,细胞因子与相应受体结合后发挥效应。由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。组织反应性：受体的分布及密度。膜型受体与可溶型受体。,细胞因子受体的共同特性,二、黏附分子的特性与功能,选择素家族(selectin family)钙黏素家族(cadherin family)整合素家族（integrin family)免疫球蛋白超家族（Immunogolobulin superfamily,IgSF),分 类,二、黏附分子的特性与功能,缺少跨膜和胞内部分，分子量小。可直接分泌到血液和其他体液。具有黏附分子的结合活性。其水平的增高程度与疾病相关：脓毒血症：可溶性E-选择素，升高

4、20倍23倍。HIV感染：可溶性L-选择素，升高2倍3倍。,可溶型黏附分子,二、黏附分子的特性与功能,参与免疫细胞的分化和发育参与免疫应答和炎症反应参与伤口愈合、血栓形成淋巴细胞的归巢参与调节细胞凋亡,生物学功能,第二节 临床常用的测定方法,重点提示,基本方法方法学评价注意事项,检测水平,基因水平：分子生物学法,蛋白水平,活性：生物学方法,含量：免疫学测定法,一、酶联免疫吸附试验,夹心法ELISA：一步法和两步法单克隆抗体或多克隆抗体用于细胞因子检测可溶型细胞因子受体或黏附分子检测首选方法,基本方法,一、酶联免疫吸附试验,特异、简便成本低、易于推广可大批量同时检测且废弃物便于处理敏感性偏低不能

5、判断细胞因子的生物学活性,优 点,缺 点,一、酶联免疫吸附试验,检测标本：建议采用血浆（肝素或EDTA抗凝血）检测条件：适时、适当刺激剂、检测时点干扰因素：标本严重溶血、污染、分泌与降解,注意事项,二、化学发光酶免疫试验,CLEIA：双抗体夹心法自动化分析体液中细胞因子或可溶型细胞因子受体的定量,基本方法,二、化学发光酶免疫试验,特异性好、灵敏度高、线性范围宽试剂稳定，可自动化检测缺点是不能区分细胞因子的生物学活性,方法学评价,三、流式细胞术,基于荧光抗体染色技术并利用流式细胞仪高分辨力所建立的方法。单个细胞水平的检测。用于细胞内细胞因子、细胞表面黏附分子和细胞因子受体的检测。,基本方法,三、

6、流式细胞术,基本步骤,1分离和培养待检细胞 2细胞破膜与固定 3封闭非特异性结合位点 4染色与分析,三、流式细胞术,区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1细胞 IFN-Th2细胞 IL-4细胞表面的黏附分子或细胞因子受体：直接或间接荧光抗体染色无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭,三、流式细胞术,具有特异、高效、灵敏等特点，进行多参数相关分析接近生物体的分析条件，更准确反映体内状况。缺点是流式细胞仪较昂贵，不易普及使用。,方法学评价,三、流式细胞术,标本处理：活细胞，保持良好状态对照选择：未刺激对照、激活对照、同型对照荧光素选择：低表达-PE、APC高表达-FITC,注意事项,四、酶联免疫斑点实

7、验,基本方法,ELISPOT每个斑点代表单个分泌待测细胞因子的细胞。斑点颜色深浅与细胞分泌细胞因子的含量相关。,四、酶联免疫斑点实验,优于传统分泌细胞的检测类似于体内的实验环境比常规ELISA 法的灵敏度高200 倍引入生物素与亲合素放大系统，可大大提高灵敏度,方法学评价,四、酶联免疫斑点实验,选用的底物应在反应后形成不溶性产物抗体：高亲和力、高特异性、低内毒素的特点同时检测两种细胞因子，如IL-2 和IL-4结核感染T细胞斑点试验,注意事项,五、免疫学测定方法学评价,影响因素较少，特异性高操作简便、快速，易于推广大部分细胞因子均有商品化试剂盒，方便检测重复性好，实验结果稳定,优 点,五、免疫

8、学测定方法学评价,所测定的只是蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比。结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系。敏感性相对较低，不如生物学测定法。干扰测定：标本中可溶性受体，某些细胞因子结合蛋白或载体蛋白。,缺 点,第三节细胞因子与黏附分子测定的临床应用,重点提示,临床应用原则特定疾病的辅助诊断,一、临床应用原则,全身免疫或炎症状态：血浆或血清细胞分泌细胞因子特性：外周血单个核细胞或相应细胞炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液细胞内定位检测：相应细胞基因表达水平：相应细胞疗效观察和预后判断：急性期和恢复期双份标本细胞表面细胞因子受体或黏附分子：细胞活性或状态,标本的适当选取,一、临床应用原则,不同的

9、检测目的，选择适宜的检测方法。联合应用不同的检测方法，综合分析检验结果。生物活性：生物学方法 基因水平：实时RT-PCR 细胞内的细胞因子：FCM,方法的联合应用,一、临床应用原则,复杂的免疫调节或效应网络系统单一检测：不能提供有效的疾病信息联合检测，综合分析,项目的联合检测,二、特定疾病的辅助诊断,细胞因子风暴变态反应性疾病自身免疫病免疫缺陷病器官移植排斥反应恶性肿瘤,细胞因子与疾病,二、特定疾病的辅助诊断,动脉粥样硬化肾脏疾病肝脏疾病自身免疫病,黏附分子与疾病,三、评估机体的免疫状态,机体免疫应答的强弱，可通过细胞因子或黏附分子的表达水平来反映。当疾病好转或恢复时，其免疫状态调整，细胞因子

10、或黏附分子也恢复正常。,四、疾病疗效监测及指导用药,人工重组细胞因子的应用选择细胞因子的种类及剂量疾病疗效监测细胞因子拮抗剂或抗体应用,本章小结,细胞因子与黏附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。免疫学测定法是细胞因子与黏附分子常用的检测方法，包括酶联免疫吸附试验、化学发光酶免疫试验、流式细胞术和酶联免疫斑点实验。,本章小结,免疫学测定法检测的是细胞因子或黏附分子的蛋白含量，具有特异性高、操作简便、重复性好，实验结果稳定，测定影响因素较少等特点。细胞因子与黏附分子的测定应结合检测标本、检测方法及联合检测做出综合考虑，主要用于：特定疾病的辅助诊断；机体免疫状态的评估；疾病疗效的监测和指导用药。,Thank you!,