中国药典版抗生素品种增修订概况文档资料.ppt

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1、一、概况:2010年版药典抗生素品种收载情况，见表：,二、2010年版药典抗生素类药标准增修订要点:1、鉴别项下尽可能应用专属性强的鉴别反应,如：光谱法：IR 色谱法：HPLC TLC等，与钠、钾、盐酸盐、硫酸盐的鉴别反应.标准中鉴别反应HPLC与TLC二法并列。有利于基层检验机构的选择。,2.新方法新技术进一步在标准中扩大应用。2.1 应用HPLC-ELSD测定氨基糖苷类抗生素的组分，有关物质，特定杂质及含量的品种进一步增加。同时又用该方法测定硫酸盐（SO4）的含量。用HPLC-ELSD替代TLC检查有关物质与组分，可 提高检测灵敏度。,如:硫酸依替米星及制剂的有关物质,硫酸盐及含量测定。硫

2、酸卡那霉素及制剂的有关物质卡B以及含量测定，硫酸庆大霉素及制剂的庆大霉素C组分及有关物质测定，硫酸小诺霉素及其制剂的组分测定。妥布霉素及制剂的有关物质测定等。,2.2 本版药典使用HPCE方法的品种有2个，其中一个为盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的含量测定。3.本版药典抗生素类增修订有关物质项较多，-内酰胺类抗生素127个品种中有116个品种采用HPLC测定有关物质。喹诺酮类46个品种就有40个品种用HPLC法测定有关物质。其他如:氯霉素类，大环内酯类，氨基糖苷类,利福平等均增修订了有关物质检查项。,3.1 对检查有关物质与含量测定的HPLC方法的系统适用性试验进行修改并完善。3.1.1 在系统

3、适用性试验中均规定了主峰与指定杂质峰的分离度，梯度洗脱时标明主峰的保留时间，使方法的可操作性强，保证了结果的准确性。,3.1.2 对杂质数多或多组分的、分离难度大的品种，中检所提供混合杂质对照品，多组分对照品及标准图谱.如阿莫西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、吉他霉素、乙酰螺旋霉素等。该混合对照品用于系统适用性试验，测得的色谱图应与标准图谱一致。便于操作，保证了方法的有效性。,3.1.3 由于系统适用性对照品及标准图谱的提供，确定各杂质峰的保留时间，有利于制剂的有关物质检查。可利用对照品溶液色谱图中杂质的保留时间，对特定杂质进行控制。3.1.4 有关物质采用自身对照时，对本身纯度低于85%的品

4、种，提出对自身对照溶液主峰进行校正。以免纯度较低品种采用自身对照法引起的结果偏高而影响正确性。,4.-内酰胺类抗生素的有关物质检查方法与国外药典基本一致，在分离度试验中根据实际情况进行修改，更有利方法的可操作性。有很多品种采用HPLC梯度洗脱法测定有关物质，如：头孢地尼，头孢唑林钠，拉氧头孢钠,阿莫西林及其复方制剂，氨苄西林等。,5.喹诺酮类抗生素的有关物质检查，EP、BP、USP均采用TLC、HPLC两种方法进行控制。本版药典提出用HPLC在主峰洗脱后梯度洗脱的方法，将EP用TLC、HPLC两种方法检测的杂质在同一HPLC系统中检测.同时根据各杂质最大吸收波长的不同，用双波长检测，对照品外标

5、法与加校正因子与不加校正因子自身对照法同时并列。杂质A用HPLC检测,灵敏度与正确性均优于TLC法。使该类品种标准的技术含量高于国外药典标准。,6.四环素类统一了该品种有关物质与含量测定的HPLC法色谱条件，与2005年版方法比较有较大改进。检出的杂质与EP6.0规定的杂质有相关性。并根据国内产品实际情况，制定合理的限度。7.氨基糖苷类用HPLC-ELSD替代TLC检查有关物质与组分，提高检测灵敏度；同时可用该方法测定硫酸盐（SO4）的含量。,8.红霉素类经对几种HPLC方法比较后，采用同一HPLC方法检查红霉素与其衍生物以及制剂中红霉素A、B、C及有关物质。有利于同类品种间质量的比较。9.有

6、关物质含量采用多种计算方法，如：不加校正因子的自身对照法，加校正因子的自身对照法，杂质对照品外标法。根据各品种杂质的情况，在同一品种中可以同时应用2种或3种的计算方法。,10.增加有机溶媒检查的品种较多。10.1 部分品种采用标准加入法，该方法可提高检测灵敏度。10.2 另由于生产工艺的不同，各生产厂使用的有机溶媒也不同，同一品种中可能有几十种的溶媒，为方便操作、经试验在标准中规定各溶剂的相对调整保留时间（RART），检查时可先做供试品，从供试品中检出的溶媒的RART与规定的RART比较，确定为何种溶媒时，再进行对照品测定，可减少工作量，大大降低检验成本，提高工作效率。,11.为保证临床使用的

7、安全有效，供注射用-内酰胺抗生素，除检查有关物质外，增加高分子聚合物的检查。在原来21个品种基础上增加至42个品种.2005年版药典-内酰胺类抗生素品种进行高分子杂质检查时，由于该方法的分析周期较长，本版药典对测定方法进一步完善，采用直径较细内径为1cm,长为30cm的玻璃柱作为色谱柱。使分析周期缩短至45-60分钟，为原来周期的1/3。,2005年版药典方法色谱柱填充剂均为sephadex G10。本版药典增加球状蛋白亲水硅胶为色谱柱填充剂的高分子聚合物分析方法12.2005年版药典氨基糖苷类、大环内酯类的含量测定方法为微生物检定法的管碟法，本版药典增加微生物检定法浊度法，二法并列。13.更

8、多的品种用细菌内毒素的检查替代热原检查。,14.大容量注射液与眼用制剂增加渗透压摩尔浓度检查。15.眼用制剂增加防腐剂检查。16.标准中涉及的已知杂质，其化学命名均在标准最后列出，便于与国外药典的杂质比较。,三、抗生素品种分类介绍 下面将重点介绍-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类、利福霉素类、喹诺酮类、抗肿瘤类、肽类的抗生素在新版药典中的增修订的情况。1.-内酰胺类抗生素 本类抗生素包括：头孢菌素类、青霉素类、酶抑制剂类、碳青霉烯类与单环-内酰胺类共127个品种，占抗生素品种的36.8%。,1.1品种收载情况：表1.1 头孢菌素类品种收载情况,头孢菌素类新增品种：原料：制剂

9、：1.头孢尼西钠 1.注射用头孢尼西钠2.头孢地嗪钠 2.注射用头孢地嗪钠3.头孢唑肟钠 3.注射用头孢唑肟钠4.头孢吡肟钠 4.注射用头孢吡肟钠5.头孢西丁钠 5.注射用头孢西丁钠6.头孢克肟 6.头孢克肟片；7.头孢克肟胶囊；8.头孢克肟颗粒7.头孢丙烯 9.头孢丙烯片；10.头孢丙烯干混悬剂8.拉氧头孢钠 11.注射用拉氧头孢钠9.盐酸头孢他美酯 12.盐酸头孢他美酯片；13.盐酸头孢他美干悬剂；14.盐酸头孢他美酯胶囊；15.盐酸头孢他美酯颗粒10.头孢孟多酯钠 16.注射用头孢孟多酯钠11.头孢泊肟酯 17.头孢泊肟酯片；18.头孢泊肟酯胶囊；19.头孢泊肟酯干混悬剂,表1.2 青霉

10、素类，酶抑制剂，碳青霉烯类与单环-内酰胺类品种收载情况,青霉素类与酶抑制剂:新增品种：原料：制剂：1.阿洛西林钠 1.注射用阿洛西林钠 2.美洛西林钠 2.注射用美洛西林钠 3.他唑巴坦 3.注射用哌拉西林钠他唑巴坦 4.阿莫西林克拉维酸钾分散片；5.阿莫西林克拉维酸钾颗粒；6.阿莫西林克拉维酸钾干混悬剂,单环-内酰胺类新增品种：原料：制剂：氨曲南 注射用氨曲南,1.2 2010年版药典本类抗生素药质量标准要点 1.2.1 性状 本类药物均为半合成的头孢菌素及其制剂，原料药外观性状一般为白色至微黄色粉末或结晶性粉末。注射用粉针剂的外观性状与原料相同。,1.2.2 鉴别 原料药与注射用粉针的鉴别

11、均采用色谱法HPLC，光谱法IR以及钾、钠离子火焰反应，也有多个品种采用HPLC与TLC二法并列。少数品种有用UV鉴别。固体口服制剂一般用HPLC或HPLC与TLC作为鉴别，二法并列。少数有用UV法作为鉴别。,1.2.3溶液的澄清度与颜色 检查溶液的澄清度与颜色是控制-内酰胺类注射用的原料药与制剂内在质量的一个重要指标。标准中大部分采用与标准管进行比浊和比色的目测法。本版药典有多个品种采用紫外-可见分光光度法在特定的波长处测定吸光度，控制溶液的颜色，如：头孢尼西钠、头孢噻肟钠。,1.2.4 有关物质 1.2.4.1 头孢菌素类药物原料27个品种均规定检查有关物质，制剂42个品种除6个品种颗粒与

12、干混悬剂由于辅料干扰未规定检查有关物质外,其他品种均有有关物质检查。头孢菌素品种有关物质检查均采用HPLC法，除头孢西丁钠以苯基键合硅胶为填充剂外；其他均以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，反相色谱，紫外检测。,其中有头孢地尼、头孢克洛、头孢唑啉钠、头孢西丁钠、头孢克肟、头孢噻肟钠、头孢噻吩钠、拉氧头孢钠、头孢呋辛钠、头孢丙烯、头孢氨苄、头孢羟氨苄及其制剂共29个品种用HPLC法梯度洗脱。,表1.3 头孢菌素的有关物质检查,1.2.4.2 青霉素类、酶抑制剂、碳青霉烯类与单环-内酰胺类原料22个品种均规定检查有关物质，制剂25个品种除5个品种片，颗粒与干混悬剂等由于辅料干扰未规定检查有关物质外,其

13、他品种均有有关物质检查。,有关物质检查均采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，反相色谱，紫外检测。其中有阿莫西林、阿莫西林钠、青霉素钠(钾)、青霉素V钾、氨苄西林、氨苄西林钠、氨曲南等原料及其制剂共27个品种采用梯度洗脱方法。,表1.5 碳青霉烯类与单环-内酰胺类 有关物质检查,表1.4 青霉素类与酶抑制剂有关物质检查,1.2.4.3 采用梯度洗脱时，由于不同色谱柱的行为略有差异，故在系统适用性试验中，应规定主峰的出峰时间，主峰与已知杂质的分离度等要求。如：头孢地尼规定:主成分头孢地尼峰保留时间约为22分钟，E-异构体峰保留时间约为头孢地尼峰保留时间的1.5倍，理论板数按头孢地尼峰计

14、算不低于7000，头孢地尼峰与其相对保留时间0.95和1.1处杂质峰的分离度均应不小于1.0。,如：头孢丙烯规定：头孢丙烯(Z)异构体峰的保留时间约为2330分钟，头孢丙烯（E）异构体峰的保留时间约为3040分钟，理论板数按头孢丙烯（Z）异构体峰计算应不小于10000，头孢丙烯（Z）异构体峰与相邻杂质峰间的分离度应符合要求。如：头孢克洛规定:头孢克洛峰的保留时间约为23分钟，头孢克洛峰与头孢克洛-3-异构体峰的分离度应不小于2.0，头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2。,1.2.4.4 由于梯度洗脱基线噪音相对较大，故规定供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.05倍或0.1倍的峰可忽略不计。以

15、免基线噪音影响结果正确性。1.2.4.5 有关物质测定结果计算可分为三种方法：(1).不加校正因子的自身对照法；(2).加校正因子的自身对照法；(3).已知杂质对照品外标法。,用杂质对照品外标法计算已知杂质的含量,用加校正因子与不加校正因子的自身对照法计算已知杂质和未知杂质的含量和杂质的总量。有关物质包括已知杂质与未知杂质，故在方法中可分别规定用杂质对照品外标法、加校正因子与不加校正因子的自身对照法计算。,如：头孢他啶中吡啶与头孢拉定中头孢氨苄均采用杂质对照品外标法。头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄中7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）及头孢哌酮钠中杂质A等均采用杂质对照品外标法。,如：头

16、孢拉定中已知杂质：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）双氢苯苷氨酸（220nm）头孢氨苄 头孢氨苄中已知杂质：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）-苯苷氨酸,头孢羟氨苄中已知杂质：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）-对羟基苯苷氨酸 头孢哌酮钠中已知杂质：杂质A（原称为头孢哌酮降介物）,如：头孢羟氨苄:供试品溶液色谱图中如有杂质峰，含-对羟基苯甘氨酸和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸按外标法以峰面积计算，均不得过1.0%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面（1.0%），其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3.0%）,供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0

17、.05倍的峰可忽略不计.,如：头孢哌酮钠 供试品溶液色谱图中如有杂质峰，含杂质A按外标法以峰面积计算，不得过3.0%，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2），其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3.0%）,供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰可忽略不计。,1.2.4.6 在检测中根据杂质最大吸收波长的不同，采用双波长测定，如：头孢拉定有关物质测定时，用不同波长 测定不同杂质，用220nm波长检测双氢苯苷氨酸，用254nm波长检测其他杂质。,1.2.5 高分子聚合物1.2.5.1 高分子聚合物是-内酰胺类抗生素临床过敏反应的一个主要因素，故在注射

18、用原料及其制剂标准中增加检查高分子聚合物，控制一定的限度，对临床用药安全有效具有重大的意义。,2005年版药典已有个品种收载高分子聚合物检查，本版药典增加到 42 个品种。其中40个品种以葡聚糖凝胶G-10(40120m)为填充剂的玻璃柱（1.01.430cm）色谱柱的凝胶色谱法测定，2个品种以球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量为10005000）为填充剂为色谱柱的HPLC法测定。,表1.6 凝胶色谱测定高分子聚合物（200年版已收载21个品种）,表1.7.凝胶色谱测定高分子聚合物（2010年版新增19个品种）,表1.8 HPLC测定高分子聚合物（2010年版新增2个品种）,1.2.5.2 国内关

19、于-内酰胺类抗生素高分子杂质的研究工作是于70年代开始，经历了近40年的研究，于2000年版药典在4个品种8个药品标准中正式收载了高分子杂质检查。2005年版药典扩大到11个品种的21个药品标准中均有高分子杂质检查。,但在2005年版药典-内酰胺类抗生素品种进行高分子杂质检查时，由于该方法的分析周期较长，加之在执行过程中涉及到较多生产厂与检验部门，工作量大幅度增加。作为常规检验方法有必要进行改进，考虑到原药典收载的方法在原理，系统适用性试验，以及方法验证专属性、重现性、准确性等方面均符合要求，而仅仅是分析周期过长.,因此在研究建立新的方法时，我们仍采用凝胶色谱的分离模式，并采用原方法中的自身对

20、照外标法，进行高分子聚合物杂质的测定。在上述二个基本条件不变的前提下进行方法学的改进,完善。1.2.5.2.1 拟采用直径较细，内径为1cm,长为30cm的玻璃柱作为色谱柱。以sephadexG10为填充剂，柱内径的缩小，柱床体积随之也变小。Kv=0也降低。分析周期缩短至45-60分钟，是原方法周期的1/3。（见图1.1，图1.3）,1.2.5.2.2 在系统适用性试验中规定分离度的要求，在高分子杂质检查时，某些药物分子单体与高聚物不能达到基线分离时，其分离度计算公式为：R=聚合体的峰高/单体与聚合体之间的谷高（分离度R应大于2.0）。,由于高分子聚合物的对照品不易获得，样品中的高聚物量较少，

21、故不能直接用样品与聚合物对照品配制分离度试验用溶液，根据本方法的分离原理，拟加入一定量的蓝色葡聚糖2000，制成含一定浓度蓝色葡聚糖2000的样品溶液来进行分离度试验。,根据上面公式，分离度随着聚合物峰高的增大而增大，故加入蓝色葡聚糖2000的量应该有一定的要求，在研究方法时，根据品种项下规定的限度及蓝色葡聚糖2000在该系统中的响应值,般加入的量为聚合物规定限度响应值的1-2倍即可。（见图1.2，图1.4）,图1.1 阿莫西林样品分析全程色谱图,图1.2 阿莫西林分离度计算色谱图,图1.3 头孢他啶样品分析全程色谱图(流速:0.8ml/min),图1.4 头孢他啶分离度计算色谱图,1.2.5

22、.2.3 方法比较 用2005年版药典方法和改进后的方法测定2005年版药典收载11个品种的F值与高聚物的含量,结果基本一致（见表1.9,1.10）。因此本版药典凝胶色谱高分子聚合物项下仅将色谱柱修订为内径1.01.4cm,长为3040cm的玻璃柱。即两种不同规格柱并列，可根据实际条件选择，测定结果是一致的。,*F值为对照品溶液浓度(g/ml)与峰面积的比值,表1.9 F值的比较,表1.10 高分子聚合物测定结果的比较,1.2.6 应用HPCE测定盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的含量，是本版药典正文收载应用HPCE的2个品种之一。,1.2.7 标准中增加有机溶媒检查的品种较多1.2.7.1 本检

23、查法大多采用涂层毛细管柱为色谱柱，等温，程序升温，顶空进样，内标法，外标法计算结果。本版药典部分品种溶媒残留检查项下采用标准加入法计算，该方法可提高检测灵敏度。,1.2.7.2 由于生产工艺的不同，各厂使用的有机溶媒也不同，同一品种中可能有几十种的溶媒，为方便操作、经试验在标准中规定各溶剂的相对调整保留时间（RART），检查时可先做供试品，从供试品中检出的溶媒的RART与规定的RART比较，确定为何种溶媒时，再进行对照品测定，可减少工作量，大大降低检验成本，提高工作效率。,如：头孢泊肟酯残留溶剂 甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、异丙醇、丁酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙酸丁酯、1,2-二氯乙烷、乙酸异丙

24、酯、苯、四氯化碳、环己烷、二氧六环、甲基异丁基酮、吡啶、甲苯 照残留溶剂测定法（附录 P）测定。色谱条件与系统适用性试验 以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液（或极性相近）的毛细管柱为色谱柱，柱温40，维持22分钟，以每分钟100速率升温至120，维持10分钟。进样口温度为200，检测器温度为250，顶空瓶平衡温度为70，平衡时间为30分钟，取系统适用性溶液顶空进样，按正丙醇（内标）、丁酮、乙酸乙酯的顺序出峰，各峰间的分离度均应符合要求。,内标溶液的制备 取正丙醇适量，用二甲基亚砜稀释制成每1ml中约含200g的溶液，作为内标溶液。系统适用性溶液的制备 取丁酮和乙酸乙酯各适量，用内标

25、溶液定量稀释成每1ml中约含丁酮和乙酸乙酯各1mg的溶液，精密量取1.0ml，置顶空瓶中，密封瓶口，作为系统适用性溶液。供试品溶液的制备 取本品约0.2g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入内标溶液1.0ml使溶解，密封瓶口，作为供试品溶液。,对照品溶液的制备 根据试验确定的具体检测对象，制备对照品溶液。分别精密称取各溶剂适量，用内标溶液定量稀释制成规定浓度的溶液，作为混合对照品溶液，混合对照品溶液中各溶剂的浓度分别为每1ml中含甲醇600 ug、丙酮1mg、异丙醇1mg、乙腈82ug、二氯甲烷120ug、丁酮1mg、乙酸乙酯1mg，四氢呋喃150 ug、四氯化碳1 ug、环己烷760 ug、苯1

26、 ug、1,2-二氯乙烷1 ug、乙酸异丙酯1mg、二氧六环76 ug、甲基异丁基酮1mg、吡啶40 ug、甲苯178 ug。乙酸丁酯1mg、精密量取混合对照品溶液1.0ml，置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。,测定法 首先取甲烷气体顶空进样，记录甲烷的保留时间作为色谱系统的死时间（t0）再取供试品溶液顶空进样，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有色谱峰，按下式计算各色谱峰的保留时间（tR）相对于正丙醇保留时间（tR（正丙醇）的相对调整保留时间（RART）；,将得到的RART值与下表的RART值比较，确定供试品中的残留溶剂种类；再制备相应的对照品溶液，取对照品溶液顶空进样，记录色谱图，按内标法以

27、峰面积比值计算，甲基异丁基酮不得过0.5%；、其他均应符合规定。,1.2.8.2-乙基己酸 对生产工艺过程中使用2-乙基己酸的原料，增加2-乙基己酸检查，采用气相色谱法测定。方法也收载在2010年版药典二部（附录 L）.如:头孢地嗪钠、头孢呋辛钠、头孢孟多酯钠、氨苄西林钠等。,1.2.9 水分 本类药物原料药均采用水分测定法第一法A测定水分，制剂中辅料对水分测定法有干扰时，则改为干燥失重。如:注射用头孢他啶，因含有10%的碳酸钠对水分测定有干扰，改为60真空减压干燥，头孢地尼胶囊也改为60真空减压干燥。,1.2.10 不溶性微粒与可见异物 供注射用的原料药增加不溶性微粒与可见异物检查,以保证制

28、剂能符合注射剂的要求。由于不溶性微粒光阻法测定结果仅与一定浓度范围内的样品溶液成正比关系，因此在标准中规定不溶性微粒检查供试品溶液浓度。,本类药物制剂规格较多，最多有11个规格。考虑临床使用的安全性，在标准中规定：规格1.0g以下的制剂按标示量折算，每1g样品中，含10m以上的微粒不得过6000粒，含25m以上的微粒不得过600粒；规格1.0g以上（包括1.0g）的制剂按每1个供试品容器中含10m以上的微粒不得过6000粒，含25m以上的微粒不得过600粒。,1.2.11 含量测定 本类共127个品种的含量测定均采用HPLC法或HPLC梯度洗脱。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，反相色谱，紫外检

29、测。为保证方法的专属性与结果的正确性。利用该类药物遇光照或加热能产生反式异构体或E异构体等有关物质。用于制备系统适用性试验用分离度溶液，测定分离度，结果按外标法以峰面积计算,即得。,如：拉氧头孢钠【含量测定】照高效液相色谱法（附录 D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L醋酸铵溶液-甲醇（19:1）为流动相；检测波长为254nm。取拉氧头孢对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液，取上述溶液适量，在80水浴中加热30分钟，冷却，取10l注入液相色谱仪，记录色谱图，拉氧头孢R异构体、拉氧头孢S异构体依次流出；拉氧头孢R异构体和

30、拉氧头孢S异构体的分离度应不小于4.0，两主峰与相邻杂质峰的分离度均应符合要求。,测定法 取本品适量（约相当于拉氧头孢25mg），精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取拉氧头孢对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品中C20H20N6O9S的含量。,如：头孢地尼【含量测定】照高效液相色谱法（附录 D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.25%四甲基氢氧化铵溶液（用磷酸调节pH值至5.5）-乙腈-甲醇（900：60：40），每1000ml中加入0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液0.4ml

31、为流动相，检测波长为254nm。取头孢地尼对照品约20mg，置100ml量瓶中，加上述0.1mol/L磷酸盐缓冲液2ml溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，在水浴中加热不少于30分钟，放冷，得每1ml中约含0.2mg头孢地尼与其降解杂质的混合溶液（其中相对主峰保留时间0.9与1.2处杂质的量各约为2%），,取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢地尼峰保留时间约为8分钟，E-异构体峰保留时间约为头孢地尼峰保留时间的3.5倍，理论板数按头孢地尼峰计算不低于2000，头孢地尼峰与其相对保留时间0.9和1.2处杂质峰的分离度均应不小于1.2。测定法 取本品约20mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，

32、加上述0.1mol/L磷酸盐缓冲液2ml溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢地尼对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,如：氨曲南【含量测定】照高效液相色谱法（附录 D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用1mol/L磷酸溶液调节pH值至3.00.1）-甲醇（80：20）为流动相；检测波长为270nm.取经紫外光灯（254nm）下照射24小时后的本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，氨曲南峰与氨曲南E异构体峰（

33、相对保留时间约1.6）的分离度应大于3.0。,测定法 取本品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取氨曲南对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,1.3 标准中涉及的已知杂质，在标准最后列出其化学命名，便于与国外药典标准中的杂质比较。如：头孢哌酮钠杂质A：(5aR,6R)-6-(2R)-2-(4-ethyl-2,3-dioxopiperazin-1-yl)carbonylamino-2-(4-hydroxyphenyl)acetylamino-5a,6-dihydro-3H,7H-azeto2,1-bfu

34、ro3,4-d1,3thiazine-1,7(4H)-dione中文名：(5aR,6R)-6-(2R)-2-(4-乙基-2,3-二氧代哌嗪-1-基)甲酰基氨基-2-(4-羟基苯基)乙酰基氨基-5a,6-二氢-3H,7H-氮杂环丁烷并2,1-b呋喃并3,4-d1,3噻嗪-1,7(4H)-二酮,如：头孢唑林钠杂质 A：R=H:(6R,7R)-7-amino-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)sulphanyl methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo4.2.0oct-2-ene-2-carboxylic acid 中文名：(6R,7R)-7

35、-氨基-3-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫代甲基-8-氧代-5-硫代-1-氮杂双环4.2.0辛-2-烯-2-羧酸杂质E：5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-thiol 中文名：5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-甲硫醇,2大环内酯类抗生素 该类抗生素可分为十四元环、十五元环和十六元环三类。它们均为多组分抗生素。十四元环有红霉素及其衍生物，具有结构相近,无紫外吸收,特征性反应不明显的特点，以红霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、罗红霉素为代表.十五元环有阿奇霉素；十六元环有乙酰螺旋霉素、吉他霉素等，,2.1 品种收载情况见表2.1表2.1 2010年版药典大环内酯类品种收载

36、情况,新增品种：原料：制剂：交沙霉素、交沙霉素片、丙酸交沙霉素、丙酸交沙霉素颗粒、麦白霉素胶囊。红霉素肠溶胶囊,2.2增修订项目概况见表2.2表2.2 2010年版药典大环内酯类品种增修订项目,2.3 本类抗生素质量标准要点2.3.1 鉴别 标准中凡用HPLC法测定组分含量以及有关物质的品种均采用HPLC法作为鉴别，并增加部分品种的TLC法鉴别，大部分品种HPLC法和TLC法并列，可任选一项；原料药也有用IR作为鉴别，如罗红霉素；有紫外吸收特性的品种也可用UV法作为鉴别，如麦白霉素、交沙霉素；部分品种采用显色反应。,2.3.2组分测定与有关物质2.3.2.1组分测定 采用HPLC法测定，组分测

37、定标准品和标准图谱由中检所提供，作为系统适用性试验的参比。如图2.1。,图2.1 130347-200403批乙酰螺旋霉素标准品组分测定典型色谱图,组分测定涉及品种共计17个，较2005年版增加8个品种，分别为:麦白霉素胶囊、乳糖酸红霉素、注射用乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素、硬脂酸红霉素片、硬脂酸红霉素胶囊、硬脂酸红霉素颗粒、红霉素肠溶胶囊，,首次对红霉素及其衍生物组分检测方法进行了统一，在其盐类及制剂中均增加了红霉素A组分的检查。具体见表2.3。,表2.3 组分测定,2.3.2.1.1 乙酰螺旋霉素与吉他霉素的组分 测定方法同2005年版,修订系统适用性试验，系统适用性对照品溶液的色谱图应与标

38、准图谱一致.2.3.2.1.2 麦白霉素的组分 主要组分有5个，2005年版仅控制麦迪霉素A1,2010版全面控制麦迪霉素A1、A2和吉他霉素A4、A6、A8；本品主成分为麦迪霉素A1，故采用麦迪霉素A1的标准品为基准,以外标法计算各组分含量.,规定（按干燥品计）：麦迪霉素A1 不得低于48%吉他霉素A6 不得低于12%5个组分总含量不得低于70%。测定方法:HPLC，色谱柱C18、检测波长232nm,2.3.2.1.3 红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素 红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素主要组分均为红霉素A、B、C.测定方法：HPLC法，色谱柱C18,检测波长215 nm；,3个品种规定限

39、度相同：红霉素A:以无水物计不得少于88.0%，用对照品外标法计算.红霉素B:不得大于5%,用加校正因子（0.7）的自身对照法计算。红霉素C:不得大于5%,用自身对照法计算。,2.3.2.2 有关物质 除琥乙红霉素仍采用TLC法外，2005年版采用TLC法的品种均修订为HPLC法，共26个品种采用HPLC法；完善了HPLC系统适用性要求，明确主峰与指定杂质的分离度，确保方法的有效性和准确性；增加特定杂质的控制（如阿奇霉素）和总杂的控制（如罗红霉素）；首次对红霉素及其衍生物有关物质检测方法进行了统一。见表2.4。,表2.4 有关物质测定(1),表2.4 有关物质测定(2),2.3.3 溶出度 除

40、乳糖酸红霉素是供注射用外，其他均为口服制剂（片、胶囊、干混悬剂、颗粒）。由于原料的水溶性较差，因此要求口服制剂检查溶出度或释放度。共25个制剂，其中2个红霉素肠溶制剂检查释放度，其他均检查溶出度；颗粒剂中包衣颗粒和非包衣颗粒制订了相应的溶出度检查法（如罗红霉素颗粒）；混悬颗粒和干混悬剂根据溶出曲线考察结果决定是否定入标准。,溶出度项下溶出液的测定，6个品种采用直接紫外可见分光光度法（231235nm波长处）、9个品种采用硫酸显色反应后紫外可见分光光度法（482nm波长处）、10个品种则采用HPLC法（阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素由硫酸显色法修订成HPLC法）。,因制剂中某些辅料与硫酸也会发生显

41、色反应，采用硫酸显色法时,采用自身对照法，以抵消辅料的干扰；同时多组分品种亦采用自身对照法，以消除组分比例差异对结果的影响。如:麦白霉素片,麦白霉素胶囊,吉他霉素片,溶出度介质可加酶，如麦白霉素胶囊和罗红霉素胶囊，后者还规定了胰酶的加量以单位表示（每1ml中含胰蛋白酶不少于0.08活性单位、胰淀粉酶不少于1.1活性单位和胰脂肪酶不少于0.4活性单位）,更为科学合理。见表2.5。,表2.5(1)溶出度测定（溶出液uv法测定）,表2.5(1)溶出度测定（溶出液硫酸溶液显色,uv法测定）,表2.5(2)溶出度测定(溶出液HPLC法测定),2.3.4 含量测定 除个别品种（如克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉

42、素）采用HPLC法外，其他品种均采用微生物检定法测定效价，见表2.6。2005版药典采用管碟法，本版药典增加浊度法，两法并列供选择，在附录中明确仲裁方法为管碟法；阿奇霉素系列由微生物法修订为HPLC法，系统适用性试验规定“标准品溶液色谱图应与标准图谱一致”；,罗红霉素系列完善系统适用性实验，增加主峰与红霉素的分离度，并明确与前相邻杂质峰（相对保留时间为0.95）和后相邻杂质峰（相对保留时间为1.2）位置；依托红霉素为红霉素酯类衍生物，故在微生物法测定含量时，必须使药物完全水解成红霉素，有抗菌活性后，方能测定抑菌能力，本版药典进行了充分研究后将水解条件由“37水浴中放置6小时”修订为“60水浴中

43、放置4小时”，缩短实验时间。,表2.6 含量测定,3、氨基糖苷类抗生素 3.1 氨基糖苷类抗生素的特点3.1.1 本类药物结构中都有以氨基环己醇与氨基糖缩合而成的苷，结构中没有共轭双键所以没有可供分析用的特征的紫外吸收仅有末端吸收，结构中具有不对称碳原子有旋光性。3.1.2 本类抗生素相对其他类抗生素而言稳定性较好，制剂为注射液品种较多。,3.1.3 本类抗生素有效成分为游离硷，一般均以硫酸盐形式存在作为药物，由于都含有易溶于水的氨基糖碱性苷，故均能以分子中的碱性基团（-NH2基）与无机酸结合成可溶于水、但几乎不溶于有机溶剂的盐类。,3.2 品种收载情况：表3.1 品种收载情况,*为新增品种,

44、3.3 关键检测项目方法一览：表3.2 检测项目方法,3.4 修订情况概要3.4.1鉴别 一般采用TLC法与硫酸盐反应，含量测定或组分采用HPLC-ELSD的方法时，也可用HPLC作为鉴别，个别品种也有用IR作为鉴别反应，少数品种有显色反应鉴别。在鉴别试验中规定TLC和HPLC两个色谱鉴别项，可根据实验室条件任选其中之一，便于灵活操作。,例1.硫酸依替米星【鉴别】（1）TLC（2）HPLC（3）硫酸盐鉴别反应。以上（1）、（2）两项可选做一项。,例2.阿米卡星【鉴别】（1）TLC（2）HPLC（3）IR（4）硫酸盐鉴别反应。以上（1）、（2）两项可选做一项。,3.4.2、检查3.4.2.1 供

45、无菌分装的原料标准正文中增加了(1)可见异物、(2)、不溶性微粒、(3)无菌。例1.硫酸阿米卡星 可见异物 取本品5份，各0.6g，分别加微粒检查用水5ml使溶解，依法检查（附录IX H），应符合规定。（供注射用）,不溶性微粒 取本品3g，加微粒检查用水100ml，制成每1ml中含30mg的溶液，依法检查（附录IX C）。每1g供试品中，含10m以上的微粒不得过6000粒，含25m以上的微粒不得过600粒。（供注射用）,无菌 取本品，加0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml中含阿米卡星8mg的供试液，经薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml），以金黄色葡萄球

46、菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H），应符合规定。（供注射用）。,3.4.2.2 渗透压摩尔浓度 2005年版药典首先在抗生素类滴眼液-硫酸卡那霉素滴眼液标准中列入渗透压检查，本版药典将其扩大为4个滴眼液，两种表示方法并列:妥布霉素滴眼液、庆大霉素滴眼液和硫酸卡那霉素滴眼液（均为渗透压摩尔浓度为260-320mOsmol/kg）硫酸新霉素滴眼液（渗透压摩尔浓度比为0.95-1.15）。,3.4.2.3 防腐剂 本版药典对氨基糖苷类抗生素滴眼液中常用防腐剂如羟苯乙酯、丙酯、苯扎氯胺等进行检查。例1.硫酸新霉素 检查羟苯乙酯 方法为HPLC（限度：80%-120%）例2.妥布霉素滴眼液 检查羟

47、苯乙酯、羟苯丙酯、苯扎氯铵，方法为 HPLC（限度：80%-120%）,3.4.2.4有关物质、组分 有关物质、组分、特定杂质检查方法修改为HPLC-ELSD方法的品种较多，但有些品种如新霉素、盐酸大观霉素仍采用TLC法。3.4.2.4.1 HPLC-ELSD方法扩大应用，2005年版药典除硫酸卡那霉素，硫酸庆大霉素,硫酸小诺霉素三个原料及其制剂共9个品种的组分、特定杂质检查方法为HPLC-ELSD方法，,2010年版药典有7个原料及其制剂共23品种采用HPLC-ELSD方法检查有关物质、组分、特定杂质。2005年版药典采用的薄层色谱法(TLC)测定有关物质，属于半定量方法，只能对杂质进行限度

48、检查，不能准确测定样品中单个杂质和总杂质量。,ELSD属于通用型检测器,几乎对所有的化合物均有响应，流动相和环境温度对响应值的影响小,适宜用于无特征紫外吸收化合物的定性和定量分析，由于其色谱响应值(峰面积的对数值)与对应的质量（溶液浓度的对数值）呈线性关系，因此用回归方程计算含量。尽管ELSD检测器在灵敏度上不如UV检测器，但较之TLC其灵敏度要高得多。,3.4.2.4.2 柱前衍生HPLC方法首次应用在中国药典氨基糖苷类抗生素有关物质检查项中，阿米卡星和硫酸阿米卡星:柱前衍生HPLC法可以在同一色谱条件下同时检出卡那霉素、杂质B、杂质A以及其它杂质，并可参考BP2009阿米卡星项下系统适用性

49、色谱图定位，且药厂出口采用此法，对本法的可行性已有数据可证明。,图3.1 阿米卡星混合溶液的分离色谱图,图3.2 BP2009阿米卡星项下系统适用性色谱,3.4.2.4.3 硫酸盐 除部分品种仍采用原滴定方法，本版药典首次采用HPLC-ELSD方法对其进行测定。2005年版中测定硫酸盐含量采用的是容量法与传统的重量法测定相比，有其先进性，但滴定终点突跃不明显.,本版药典建立的HPLC-ELSD方法测定硫酸盐含量，采用硫酸滴定液作为对照品，解决了对照品的问题，该方法方便、准确。例如：2010年版药典中;硫酸西索霉素、硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星硫酸依替米星均采用HPLC-ELSD方法测定硫酸盐含量

50、。,3.4.4 含量测定 有以下五种形式，表3.3（1）硫酸卡那霉素，硫酸依替米星及其制剂共7个标准的含量测定为HPLC-ELSD方法。（2）阿米卡星和硫酸阿米卡星及其制剂共4个标准的含量测定采用柱前衍生化HPLC-UV方法。（3）硫酸新霉素 硫酸核糖霉素及其制剂共5个标准的含量测定采用微生物检定法管碟法.,（4）盐酸大观霉素及其制剂共2个标准的含量测定采用微生物检定法浊度法（5）其他21个标准的含量测定均采用微生物检定法管碟法和微生物检定法浊度法两法并列，可任选一方法。,表3.3 含量测定,4、四环素类抗生素4.1 四环类抗生素的基本特点，4.1.1 结构特点 四环素类抗生素为四骈苯或萘骈萘