[理学]细胞培养与实践讲义讲.doc

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1、细胞培养与实践讲义 第一章 细胞培养基本知识 组织培养工作始于本世纪之初（Harrison 1907, Carrel 1912），现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为重要的基础科学之一。这里仅讨论动物的组织或细胞培养，简称为组织或细胞培养。本名词泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。若以产生形成培养物的方法而言，可分为组织培养、细胞培养和器官培养。组织培养指把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。细胞培养是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养、生长。由于主要成分均属

2、细胞，而这些细胞在体外生长时，仍然是相互依存、互相影响的。因此，细胞培养与组织培养实际上区别不大，本书将细胞培养与组织培养以相同的含义使用。此外，体外培养中尚将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存并同时保持其一定的结构和功能特征，称为器官培养，与一般的细胞或组织培养相区别。组织或细胞培养的主要优点：（1） 研究的对象是活的细胞。在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期地监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。（2） 研究的条件可以人为地控制。进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制包括pH、温度、O2、CO2张力等物理化学的条件，并且可能做

3、到很精确以及保持其相对的恒定。同时可以施加化学、物理、生物等刺激，而进行实验、观察。（3） 研究的样本可以达到均一性。取自一般的组织样本，其构成的细胞类型含有多种，即使是来源于同一组织，也不能做到均一性。但是，通过细胞培养一定的代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属同一类型的细胞；需要时可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。（4） 研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用各种技术和方法来观察、检测和记录，充分地满足实验的要求。（5） 研究的范围比较广泛。多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的

4、各类组织。（6） 研究的费用相对较经济。由于细胞培养有可能大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内试验经济得多。 细胞培养存在的不足。其最根本的问题是尽管培养技术不断发展，并努力创造条件以模拟动物体内状况，但是体外培养的组织或细胞与体内相应者仍然存在差异。可以说，任何组织或细胞置于体外培养后，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。这一点，在进行研究、分析时应予注意。细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一。体外培养的细

5、胞，尤其是反复传代、长期培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。另外，细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。这些都影响细胞培养技术的更广泛应用。利用这一技术，可进行多方面的研究。（1） 细胞与细胞之间的相互作用。（2） 细胞内部与细胞外界之间的作用。（3） 细胞内胞质的活动。（4） 胞质与胞核之间流动。可广泛应用于各个领域：1病毒学： 近年来病毒学中的很多发展与能在培养细胞中生长病毒的技术有关。如很多病毒疾病可用抗体血清治疗，因此需要。利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。2 免疫学： 杂交瘤一单克隆抗体技术极大地促进了免疫学的发展，而这种技术就是在细胞培养技术的基础上发展起来的。

6、3遗传学： 可以利用细胞培养技术进行染色体分析。由于细胞融合技术的引入，与遗传学技术相结合建立了体细胞遗传学，并已成为包括人在内的高等脊椎动物遗传学分析的一个重要的组成部分。4肿瘤学：细胞培养技术已广泛应用于肿瘤学的领域，促进了对肿瘤的了解。有关内容在肿瘤细胞培养中介绍。5分化及发育：高等动物真核细胞分化的研究是比较困难的，现在利用体外培养对分化进行研究，例如：经一已知的外界因素刺激后，有些细胞群体可发生改变，这些改变可以被确认并进行监测。6细胞毒试验： 虽然体外细胞培养的结果尚不能完全地反应出整个动物的情况；但可以说，若某一物质对几种不同的细胞系均产生有害影响，当把这物质使用于整个动物时，预

7、期产生不良效应的可性极大。7临床医学及生物技术方面的应用： 例如：在合适的宿主细胞的培养可作病毒感染的定性及定量分析；以细胞培养作克隆、微量分析或其他体外检测分析方法检测药物的效应。此外，并已用于某些治疗目的，如将某些细胞体外培养，经适当处理后重新导入动物体内以达到治疗目的，例如：经体外刺激生长的淋巴细胞可用以改善对肿瘤的免疫反应。一、培养细胞的特性（一）、培养细胞的生长方式及类型体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴附型与悬浮型两大类。1 贴附生长型细胞： 为能附着于底物（支持物）表面生长的细胞。活体体内的细胞当离体置于体外培养时大多数均以贴附型方式生长。必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴附依

8、赖性细胞。 目前已有很多种细胞能在体外培养生长，这些细胞在活体体内时，各自具有其特殊的形态；但是体外培养状态下的贴附生长型细胞则在形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 上皮细胞型：这种在体外培养中称为上皮型细胞的细胞并不完全等于活体内真正的上皮细胞，而是指那些形态上类似上皮细胞的多种培养细胞。来源于外胚层及内胚层的细胞，体外培养时均属此型。培养中的上皮细胞形态为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形的细胞核。其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，具有连接成片能力。 成纤维细胞型：起源于中胚层组织的细胞，体外培养时属此型。本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞，

9、具有长短不等的数个细胞突起，因而多呈梭形、不规则三角形或扇型，核为卵圆形位于靠近胞质的中央。其生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为漩涡状、放射状，或似栅栏状。体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同。2悬浮生长型细胞：少数细胞类型在体外培养时不需要附

10、着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察时细胞呈圆形。由于悬浮生长于培养液之中，因此其自下生存空间大，具有能够提供大量细胞、传代繁殖方便、易于收获细胞等优点，并且适于进行血液病的研究。缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。（二）、培养细胞的生长特点 细胞在体外培养生长时具有一些特点。其中特别是贴附和接触抑制、密度依赖性。1贴附 贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而长生，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于底物

11、之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。细胞附着于底物并非一种要能量的过程，一般认为与电荷有关。一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液以及血清之中。在培养过程中，这些带阳电荷的促细胞附着因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长时期在悬浮中生长而将逐渐退变。细胞的贴附和伸展可以分为几个阶段。以纤维细胞为例。一般在细胞接种后，约510min便可见细胞以伪

12、足初期附着，与底物形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展开，细胞体的中心部分亦随之变为扁平；最后，细胞成为成纤维细胞的形态。细胞的贴附和伸展，首先底物须具备一定的条件（如上述的促附着因子等）。另外，尚可受一因素的影响。例如：离子的作用。如细胞的伸展需要有钙离子的存在，而含低浓度钙的培养液不利于细胞伸展。机械、物理因素也可影响的附着。如低温或培养液的流动过快均可妨碍细胞的附着。有些生物因素对细胞的伸展可能有影响。如表皮生长因子可刺激神经胶质细胞的皱褶活动，成纤维细胞生长因子能减少3T3细胞在底物上的扁平程度。2接触抑制及密度依赖性 接触抑制是体外培养中某些贴附型细胞的生长特性之一。正常的细胞

13、存在不停顿的活动或移动，其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动。但是，当两个细胞移动而互相靠近时，其中之一或二个将停止移动并向另一方向离开，这保证了细胞将不会重叠。当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动将停止。此即接触抑制。因此，一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。 3T3细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿约106个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特性即为密

14、度依赖性调节（或密度抑制）。转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的终末细胞密度。（三）、培养细胞的生长过程1单个细胞的生长过程：细胞周期 所谓细胞周期是为研究细胞的生长行为而提出的。在动物体内或在体外培养中，细胞的处于生长或静止状态。细胞生长包括DNA合成及细胞分裂两个关键过程。细胞周期即一个母细胞分裂结束后形成的细胞至其下次再分裂结束形成两个子细胞的这段时期，可分为间期和M期（分裂期）两阶段。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于M期。一般间期的时间较长，而M期的时间较短。在间期，细胞完成生长过程，主要为DNA的合成，即遗传物质的分配。在间

15、期中DNA合成仅占其中的一段时间，称为DNA合成期（S期）；在S期之前和之后，分别有两个间隙阶段，称为DNA合成前期（G1期）及DNA合成后期（G2期）。因此，可将细胞周期归纳如下：间期=G1期+S期+G2期细胞周期=间期+M期=G1期+S期+G2期+M期G1期：DNA合成前期，为下一步DNA复制和蛋白质合成作准备。包括初阶段时RNA的合成、cGMP及cAMP脱氧核苷酸、胸苷激酶等。各种细胞G1期持续时间的长短差异较大，短者45h，长者可达数日。S期：即DNA合成期。本期的细胞活动主要为DNA的合成、复制。各种细胞的S期持续时间差别较小，约在230h之间，平均约68h。 G2期：为DNA合成后

16、期，又称细胞分裂前期。主要的变化是RNA及蛋白质的合成、还有染色质的螺旋化等。持续时间较短，约23h或再略长。 M期：为有丝分裂期。是细胞周期的终结期，此时每个细胞将分裂2个子细胞。M期整个持续时间很短，也较稳定，一般只有12h左右。细胞分裂的进程又分为有丝分裂的前期（2030min）、有丝分裂的中期（2030min）、有丝分裂的后期（56min）、有丝分裂的末期（2030min）。 整个细胞周期的持续时间和细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，一般说来，哺乳动物细胞的细胞周期约1030h。其中S期、G2期及M一起为10h左右，不同细胞的变异程度较小；而G1期持续时间差别则较明显。因此，

17、某种细胞的细胞周期时间的长短主要与G1期的关系密切。2细胞系的生长过程取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前称为原代培养或原代细胞。由于体内细胞生长在动态平衡环境中，与此不同，组织培养细胞的生存环境是瓶皿或其它容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代。传代生长以后，便成为细胞系（cell line）。在体外培养的细胞，其生命的期限并非无限的。当细胞自动物体内取出后，在培养中大多数的细胞仅持续生长一有限的时间，然后将自行停止生长。即使提供以这种细胞生长所需的包括血清在内的营养物质，最终仍致死亡。一般正常细胞的这种细胞系的寿命

18、只能维持一定的时间期限，称为有限生长细胞系。细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物种族。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代（Hayflick）；恒河猴的皮肤成纤维细胞亦能传代超过40代（Hsu）；鸡胚胎成纤维细胞在培养中则最多只有少数克隆能群体倍增三十多次（Beug）；而小鼠成纤维细胞的寿命最短正常者多数生长8代左右（Meek）。在体外培养时，不同组织来源及取自不同年龄的人成纤维细胞的平均寿命也是不同的。例如：从年老的个体取得之成纤维细胞的寿命比取自年轻者短。此外，可能影响培养细胞寿命的因素还有培养的条件等，如在上皮细胞的培养液中加入表皮生长因子，则可能使之延迟衰老，寿命

19、可从50代延长到150代（Rheinwald）。体外培养细胞寿命分为三个阶段：原代培养或初代培养期（primary culture）：为自体内取出并在体外培养长至第一次传代的时期。一般约14周。此期中的细胞移动比较活跃，细胞分裂并不旺盛。原代培养的细胞与体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性质。因此是一些实验如药物试验等的良好工具；但是，此期中生长细胞包含的类型较多，需要注意。传代期（passage或subculture）：原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的培养器皿中，即传代。这种传代

20、大约数天至1周即可重复一次，持续数月，此即细胞系，一般是有限细胞系。传代期的细胞增殖旺盛 ，一般是二倍体核型，并保留原组织细胞的很多特征。但当继续长期反复传代，细胞将可逐渐失去其二倍体性质，至一定期限后（如一般为传代3050次后）细胞增殖变慢至停止分裂，进入衰退期。衰退期：一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退、死亡。 在体外培养细胞的生命期间，有所谓“危机期”（crisis）。有限细胞系生长过程中若不能通过“危机期”，将进入衰退期而趋于死亡。但是，并非所有原代培养的传代细胞最后全部都发生死亡，而是，传代中偶而可有极少的后代细胞能通过“危机期

21、”，获得不死性（immortality）而具有持久或无限增殖的能力。这种细胞即称为无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line）。过去亦称为已建立的细胞系。细胞无限繁殖生长的能力是否可以获得，与其种族、来源及性质有关。至今，国际上及国内已建立了许多细胞系，其中大多数来自肿瘤。3每代细胞的生长过程所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与接种细胞数量、细胞生物性状以及营养液的性质等有关。接种细胞数量大，即细胞基数大，细胞数量饱和速度相对要快；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增

22、殖较快；培养液中血清含量多时细胞增殖快。以上情况都会缩短传代时间。在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中称为接种。细胞自接种至新培养皿至其下一次再传代接种的时间为细胞的一代。每代细胞的生长过程可分为三个阶段：滞留期：包括悬浮期（游离期）及潜伏期。当细胞接种入新的培养器皿，不论是何种细胞类型、其原来的形态如何，此时细胞的胞质回缩，胞体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间后，那些尚可能存活的细胞，即开始附着于底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。再经过一潜伏期，此时细胞已存活，具有代谢及运动但尚无增殖发。一般细胞滞留期的时间不长，约为2496h。 指数生长期：此期细胞增殖旺

23、盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。此期一般约可持续35天。平台期：又称生长停止期。此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将

24、于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。二、培养细胞生长的条件（一）、细胞的营养需要体外培养的细胞，首先需要提供其生存的营养需要的条件。在组织培养技术发展的早期，多数细胞是于血浆、血纤维蛋白原凝块中，或在组织提取物等中生长的。经过反复的研究，人们已证实体外培养细胞如体内一样需要一些基本营养物质及促生长因子等物质。1基本营养物质 体外培养细胞的生长必需一些基本的营养物质，包括氨基酸（必需的异亮氨、亮氨酸、胱氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸、另外尚需谷氨酰胺。维生素也是维持细胞生长的生物活性物质，其中有些是不可少的，如：烟酰胺、叶酸、

25、核黄素、B12、泛酸、吡哆醇及维生素C。碳水化合物提供细胞的能源，其中主要的是葡萄糖。此外，培养细胞的生长尚需要钠、钾、镁、磷、氮等基本的无机离子。2促生长因子等物质：体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等物质才能正常生长、繁殖。 血清中含有多种上述细胞生长所需的物质，有利于多数细胞的存活和生长；但同时也有对细胞有害的成分。3其它条件 细胞的生存环境除了满足营养的需要以外，培养环境还必须具备细胞生长并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性。 温度：体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长，其适宜的温度与取材的动物种类有关。在达到有限的值之前，一般细胞繁殖率因温度升高而

26、增加，但当温度进一步升高超过此值后，繁殖将迅速变成抑制。培养温度如不适当，将会影响细胞的代谢及生长，甚至发生死亡。一般说，高温比低温对细胞的影响细胞更为明显。细胞在4能存活数天；若加保护剂可于液氮中冷冻至196。细胞置于高温时则不同，不能忍受温度升高2持续数小时。在4142中培养1小时，损伤严重；至43以上时则多数细胞将死亡。 气相及pH：体外培养细胞需要一理想的气体环境。多数细胞需要在有O2条件下才能生长，氧张力通常维持在略低于大气状态，若O2分压超过大气中氧含量可能对有些细胞有害。体外培养细胞采用开放培养时，其气体环境一般应为95%空气加CO2的混合气体。CO2为细胞生长所需要，同时又是细

27、胞代谢的产物，并与维持培养基的pH有关，CO2 增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6可能对细胞有害甚至退变或死亡。一般来说，偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。为了使培养环境的pH保持稳定，多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。渗透压：多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力，理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，由于人类血浆的渗透压约为290m mol/L，因此，可以认为这是体外培养人类细胞的理想渗透压。而鸡胚成纤维细胞大约为275325m mol/L，鼠则为310m mol的渗透压可适于大多数细胞。无污染及无毒：体外培养的细胞必

28、须生长于无污染及无毒的环境。无毒是培养细胞的必须条件。凡与细胞直接或间接接触者若具细胞毒性，在培养过程中将导致细胞的死亡。因此在选用这些器皿、材料时必须注意。细胞培养中的污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及上面所述有害物质的污染。体外培养的细胞由于缺乏机体的免疫系统等机制而失去对微生物的防御能力，若发生细菌等微生物的污染，细胞最后终至死亡。污染的另一问题是不同细胞类型的交叉污染，其发生的机会常为人们所忽视。细胞的交叉污染，可使实验室原来的细胞系失去原有特性。因此，也应引起足够的重视。为了避免交叉污染，对不同的细胞系操作时要特别注意，例如避免使用同一瓶培养液或试剂；已曾伸入一

29、种细胞培养瓶中的吸管不应再放置于培养液瓶之中。第二章 细胞培养室的设置和准备工作一、细胞培养实验室的设置及设备（一）、 细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。近年来，由于超净工作台的使用，大大方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。各部门最好分别设于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置；如安置在一大实验室内，无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而制备、储藏和孵育区位于此两区之间。1无

30、菌操作区（1） 无菌操作室 无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。无菌操作室理想地应划分为更衣间、缓冲间及操作间三部分。更衣间供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。缓冲间位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境。无菌操作间为密闭式，一般无菌操作间的空气消毒用紫外线或电子消毒灭菌器。消毒后室内的残留臭氧只需3040min即能自行还原成氧气，室内不留异味，消毒物体表面不留残毒。（2） 净化工作台 目前大多数从事培养工作的实验室都装备了超净（净化）工作台。这种工作台操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好，为培养工作提供了良好的无菌操作

31、环境。即使在不装备单独的无菌操作间的情况下，只要安装了超净工作台，也能基本上满足简单的细胞培养工作的需要。一种是侧流式或称为垂直式；另一种为外流式或称为水平层流式。 基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精虑，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同，侧流式工作台空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，都能形成气流屏障保持工作区无菌。外流式（水平式）是使净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作区，但如进行有害物质实验操作

32、则对操作工作者不利。 （3） 简易无菌操作箱在条件比较简单的实验室，要进行组织细胞培养实验，可采用自制的单人或双人无菌操作箱。箱内可安装紫外线灯供消毒灭菌和日光灯照明，操作时仅双手伸入箱内，亦可达到一定的无菌条件。由于箱内空气不流动，温度较高，因此操作时间不宜太长。2孵育区 本区对无菌的要求虽不必如无菌区那样严格，但仍需清洁而无灰尘，因此也应在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用较高，一般实验室多采用孵箱进行。3制备区该区主要进行培养液及有关培养用液等的制备。4储藏区 对储藏区的要求是取放方便，主要有冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清

33、洁、无灰尘。5清洗和消毒灭菌区清洗和消毒灭菌区应与其它区分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等的工作。（二）、细胞培养实验室设备组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。1常用的基本设备 为组织细胞培养工作的必需设备，缺少则无法进行工作。（1） 仪器 显微镜：一台简单的倒置显微镜 是组织细胞培养室所必需的。若有条件，尚可添置解剖显微镜、荧光显微镜、录相系统或缩时电影拍摄装置等。 培养箱：体外培养的细胞和体内细胞一样，都需要在恒定的温度下才能生存，因此需要有能控制温度的培养箱。如恒温培养箱及CO2培养箱，均要具有较高的灵敏度。一般恒温培养箱应选用

34、隔水式或晶体管自控恒温培养箱，这些培养箱比一般普通培养箱灵敏度高，温度也较稳定。多数的细胞培养实验室已使用CO2孵箱。其优点是恒定的提供所需要的一定量的CO2，使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。 干燥箱：用于细胞培养的有些器械、器皿要烘干才能使用，玻璃器皿需干热消毒，因此，细胞培养实验室均配置有电热干燥箱。干热消毒时，升温较高，一般需达到160。 水纯化装置：细胞培养对水的质量要求很高，所用的水必须事先纯化处理。水纯化时可采用离子交换纯水装置或蒸馏器。离子交换纯水时，尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再蒸馏。进行细胞培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水；即使用于玻璃

35、器皿的冲洗，至少也应是二次蒸馏水。 冰箱：细胞培养室必须配备有普通冰箱或冷藏箱，最好有一台低温冰箱（20）。前者用于储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。20低温冰箱则用于储存那些需要冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。 细胞冷冻储存器：细胞培养工作中常需储存细胞，常用的是液氮容器。液氮容器的大小可自25500L，可以储存1ml的安瓶25015000个左右。液氮温度很低，达196，使用时要防止冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮情况，及时定期补充液氮，避免挥发过多而致细胞受损。 离心机及天平：进行细胞培养时，常需要制备细胞悬液、调整细胞密

36、度、洗涤、收集细胞等，因此要使用离心机。 消毒器：直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。 滤器：目前培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能。因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常用的滤器有Zeiss滤器、玻璃器和微孔滤器。（2） 培养用器皿 培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。 培养瓶：由玻璃或塑料制成，主要用于培养、繁殖细胞。国产培养瓶的规格常以容量表示，如：250ml、100ml、25ml等；进口培养

37、瓶则多以底面积（cm2）表示。培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。多孔培养板：可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本。常用的有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。 培养操作有关器皿玻璃瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。吸管：主要有刻度吸管及尖吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，尖吸管又有直头吸管及弯头吸管之分，除可作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀传代细胞。 加样器：用于吸取、移动液体或滴加样本。常用微量加样器，可保证实验样

38、品含量精确，重复性良好。 其它用品 尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的大玻璃筒，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡皮吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子，冻存细胞用的安瓿或冻存管，不同规格的注射器，烧杯和量筒以及漏斗等。（3） 器械主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。2特殊设备细胞培养实验室除了应配备有上述的常用基本设备以外，如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，使实验室工作做得更有效、更精确、更深入。有关的特殊或先进设备如下：酶联免疫检测仪，可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等；超低温冰箱，70以下的

39、冰箱便于储存有些试剂及标本；旋转培养器，用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养；荧光显微镜，进行荧光染色样本的观察；更精确及快速检测细胞用的流式细胞仪等。二、培养用品的清洗和消毒灭菌组织培养工作需要使用大量的器材，虽然在国际上很多器材已倾向一次性使用，但目前我国尚未普及，仍需要反复使用各种器材，特别是玻璃器皿。所以在组织培养工作中清洗和消毒灭菌仍是一项极为繁重而艰苦的任务。（一）、培养用品的清洗（1） 清洗 在组织培养中，细胞对任何有害物质都十分敏感，因此对新的或用过的培养器皿都要严格清洗。 玻璃器皿：玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洗干净，而

40、且要带适当的电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCl或H2SO4中和。清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。浸泡：新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，同时常有许多灰尘干涸在上面，使用前必须彻底清洗。先用自来水初步刷洗，在5%稀盐酸溶液中浸泡过夜，以中和其碱性物质。 刷洗：经浸泡后的玻璃器皿尚须刷洗。刷洗时应注意防止损坏器皿内表面光洁度以免影响细胞生长，所以应选择软毛毛刷和优质的洗涤剂，刷洗后要将洗涤剂冲净，晾干。 清洁液浸泡：清洁液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强，

41、对玻璃器皿无腐蚀作用。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。浸泡器皿时，同样要注意防止烧伤，轻轻将器皿浸入，使之内部完全充满清洁液，不留气泡，一般最好浸泡过夜，至少为6h以上。 冲洗：玻璃器皿经浸泡后必须用流水冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，直到清洁液全部被冲净，不留任何残迹为止。再用蒸馏水漂洗23次，最后用三蒸水漂洗一次。烤箱内烘干备用。 胶塞、盖子等杂物 组织培养中使用的胶塞、培养瓶盖子、针头都不能以清洁液浸泡。清洗过程中，新的胶塞因带有滑石粉，应先用自来水冲洗干净，再进行常规清洗；用后胶塞、盖子应及时浸泡在清水中，用洗涤剂刷洗。针头需用自来水冲洗

42、干净，然后置入2%NaOH中煮沸1020min，冲洗干净；再以1%稀盐酸浸泡30min，冲洗；用蒸馏水漂洗23次，最后三蒸水漂洗1次，晾干备用。 塑料器皿 组织培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品是主要是进口的一次性商品。若需重复使用，器皿经冲洗干净后，晾干，2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5%盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗。（2） 包装 组织培养的器皿要清洗晾干。在消毒前必须进行包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。（二）、培养用品的消毒灭菌 造成组织细胞培养失败的主要原因之一是发生污染，特别是微生物的污染。组织细胞培养中所使用的各种培养

43、基，对细胞来说是体外培养必不可少的，同时，对微生物也是最合适的营养物。若有微生物污，微生物可比细胞生长更迅速，并可产生毒素影响细胞的生长甚至使其死亡。1消毒灭菌的方法 根据材料的要求可采用不同的消毒灭菌方法，总的说来有物理方法及化学方法两大类。物理方法包括用湿热（高压蒸气）、干热、紫外线、射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。（1） 干热消毒 一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，需加温到160，保持90120min

44、方能杀死芽胞。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。（2） 湿热消毒湿热消毒是一种很有效的消毒方法，一般使用高压蒸汽灭菌器进行。高压消毒可在50、10、15、20磅的压力下进行，持续时间可为10、15、20、30min。根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20min，有些常规使用液体要消毒15磅15min，橡胶用品为10磅10min。煮沸消毒可用于注射器及某些用具的快速消毒，缺点是湿度太大。（3） 紫外线消毒：紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气

45、、操作台表面及桌椅等消毒。但在房内安装不能高于2.5米，要使各处能有0.06微瓦/cm2能量照射，否则影响消毒效果。也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿。缺点是有臭氧产生，污染空气，影响身体健康。（4） 过滤除菌消毒 有很多组织细胞培养使用的液体不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等，可采用过滤方法以去除细菌等微生物。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可为石棉板、玻璃或微孔膜。常用的滤器有以下几种。 Zeiss滤器 这种滤器为不锈钢的金属结构，中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板。滤板具有一定的厚度，可承受一定的压力，因此

46、是过滤血清等粘稠液体较理想的滤器。滤板有不同规格，进口的型号EKS1、EKS2、EKS3等。国产的有甲1、甲2、甲3等，其中以EKS3及甲3过滤除菌的效果较好，但因孔径很小，速度较慢。滤器可分为抽滤式或加压式。抽滤式滤器与抽滤瓶相连，真空泵抽气形成负压以过滤液体，其效率不如加压式。加压式滤器的容器为密闭式，加入待过滤的液体后，通以气体（常用N2、O2或CO2），形成压力将液体滤过，效果较佳。使用时注意压力不能过大，不应超过0.2kg/cm2。Zeiss滤器的清洗比玻璃滤器简单，滤板属一次性，使用后即可弃去，以自来水将金属滤器初步冲洗，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲净，蒸馏水漂洗23次，最后三蒸水漂

47、洗1次，晾干包装。消毒前将滤板装好，旋钮不要拧得太紧；消毒后立即将旋钮拧紧以保证过滤除菌的效果。 玻璃滤器 这种滤器为玻璃结构，以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上。可用于过滤除血清等粘稠液体以外的各种培养液体。只能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小，分为G1G6六种规型号，其中只有G5及G6可有以滤过除菌，一般都使用G6型。其缺点是速度较慢。玻璃滤器的使用方法与抽滤式Zeiss滤器相同。 微孔滤膜滤器 这种滤器的基本结构与Zeiss滤器相同，为金属结构，但其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜。可用于包括血清在内的各种培养液体的过滤除菌，速度较快，效果较好，现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大小而划分其型号，可按待滤过液体的量来选择适当的型号。用于小量培养液时，可选用2.5cm直径滤器，以注射器推动为压力而过滤。微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，以加压式更佳。滤膜的选择是效果好坏的关键。有孔径为0.6m、0.45m 、0.22m三种滤膜，有以滤过除菌时，最好使用 0.22m孔径的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。由于滤膜很薄，在滤器的上层和下层的相应部位各有一凹槽以放置一硅胶垫圈来固定、压紧滤膜。安装滤膜时要注意；滤膜薄而且光滑，容易移动，千万不能装偏而使过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应向上。由于滤膜薄，承受压力有限，力量