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1、DNA的粗提取与鉴定,基础知识:1、DNA粗提取的原理2、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面?,提取DNA的原理包括DNA的溶解性和耐受性两个方面。DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精。,思考1分析图51DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?要使DNA溶解,需要使用什么浓度?要使DNA析出,又需要使用什么浓度?,在0.14mol/L时溶解度最小;较高浓度可使DNA溶解;0.14mol/L可使DNA析出。,思考2 在溶解细胞中的DNA时,人们通常选用2mol/LNaCl溶液;将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水,以稀释NaCl溶液。酒精
2、是一种常用有机溶剂,但DNA却不能溶于酒精(特别是95冷却酒精)但细胞中蛋白质可溶于酒精。问:采用DNA不溶于酒精的原理,可以达到什么目的?,将DNA和蛋白质进一步分离,思考3 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时,应选用怎样的酶和怎样的温度值?,蛋白酶,因为酶具有专一性,蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为6080,因为该温度值蛋白质变性沉淀,而DNA不会变性。补充:DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋,其温度在80以上,如在PCR技术中DNA变性温度在95。,DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用什么指示剂进行鉴定?
3、,在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺呈现蓝色,原理总结:1、利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯DNA;2、利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来 达到提纯的目的;3、利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是 DNA,1、实验材料不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时,应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA?从核DNA数目来看,猪38条,鸡78条,哺乳动物血0条,猕猴桃58条,洋葱16条,豌豆14条,菠菜12条,大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。,哺乳动物的血液和液体培养基中的大肠杆菌。,鸡血、猕猴桃。,2、破碎细胞
4、,获取含DNA的滤液若选用鸡血和洋葱作实验材料,则怎样获取含DNA的滤液?在以上实验中,加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么?过滤时应当选用(滤纸、尼龙布)。,在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌,过滤后收集滤液;切碎洋葱,加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,过滤后收集滤液。,血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂;洗涤剂瓦解细胞膜;食盐溶解DNA物质;选用尼龙布进行过滤。,思考:在处理植物组织时需要进行研磨,其目的是什么?研磨不充分产生什么结果?具体做法:10mL鸡血20mL蒸馏水同方向搅拌3层尼龙布过滤滤液,破碎细胞壁,使核物质容易溶解NaCl 溶液中;研磨不充分会使DNA的提取量减少,3
5、、去除滤液中的杂质方案一:30mL滤液35gNaCl同方向搅 拌,DNA溶解加入蒸馏水DNA析出过滤得到过滤物放到2mol/LNaCl溶液中溶解DNA-NaCl溶解液方案二:30mL滤液嫩肉粉(木瓜蛋白酶)静置1015分钟DNA滤液方案三:30滤液6067处理过滤获得DNA滤液,方案一的原理:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同方案二的原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理:蛋白质和DNA的变性温度不同。,4、DNA析出与鉴定(1)在滤液中仍然含有一些杂质,怎样除去 这些杂质呢?得到的DNA呈何颜色?滤液与等体积的冷却酒精混合均匀,静置23分钟析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。(2)怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢?阅读教材。,简述DNA的鉴定过程。具体做法:试管2支,编号甲、乙各加等5mLNaCl溶液甲中放入少量白色丝状物,使之溶解各加4mL二苯胺,混合均匀沸水浴5min观察颜色变化,DNA的鉴定,其它注意事项:1、在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;2、鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度;3、使用塑料烧杯;使用尼龙布过滤;4、玻棒沿同一方向搅拌;5、玻棒搅拌要缓慢(细胞破裂快速搅拌);玻棒不要碰到烧杯壁;6、二苯胺试剂要现用现配等。,拓展:,为了提高DNA纯度,在科学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)。,
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