第九章 蛋白质和氨基酸的测定.ppt

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1、第九章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述第二节 凯氏定氮法第三节 蛋白质的快速测定法第四节 氨基酸总量的测定,第一节 概述,蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标；测定蛋白质含量对于评价食品营养价值、提高产品质量等具有重要意义；主要含有C、H、O、N，含N是区别于其他有机化合物的主要标志；蛋白质系数：指1份氮相当于蛋白质的份数。一般蛋白质含氮量16%，蛋白质系数为6.25。不同食品蛋白质系数有所差异。,蛋白质的测定方法分两大类：利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。食品种类多，pro含量

2、不同，碳水化合物，脂肪和维生素等干扰成分很多。凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数，是测定蛋白质最常用的方法。具有准确、简便的优点。其他方法：双缩脲法、紫外吸收法、水杨酸比色法、福林-酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。氨基酸测定的常用方法：双指示剂甲醛滴定法、茚三酮比色法、自动分析仪法。,新鲜食品中含氮化合物以蛋白质占优势，所以检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱，含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。三聚氰胺事件：俗称密胺、蛋白精，为含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，主要用于木材加工、

3、装饰板、涂料、纸张、纺织、皮革等行业。三聚氰胺色白无味，含N约66%，非法掺进奶粉等食品中，可提升蛋白质的检出量。,第二节 凯氏定氮法,三聚氰胺,原理凯氏定氮法分常量、半微量、微量、自动，原理相同，都要经过消化、蒸馏、滴定三步骤。样品与浓硫酸和催化剂(K2SO4及CuSO4)一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵；然后加碱蒸馏，蒸出氨，用硼酸溶液吸收；以标准盐酸或硫酸溶液滴定吸收的氨。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,K2SO4 的作用：消化过程中提高溶液沸点从而加快有机物分解。一般纯H2SO4沸点为340，K2SO4与

4、硫酸反应生成KHSO4，可以提高温度至400以上，加快有机物分解。硫酸钾加入量不能太大，否则易造成温度过高，生成的铵盐分解损失。也可用Na2SO4 等其他盐类来提高沸点。CuSO4的作用：作为催化剂，加速反应进程；消化完全的指示作用：反应中不断生成硫酸亚铜褐色沉淀，消化完全后，不再有沉淀生成，变为蓝绿色澄清透明；也可以用氧化汞、汞、锡粉、二氧化钛等代替。其他：消化过程通常也加入少量H2O2，KClO等强氧化剂，以加速有机物氧化分解。,反应式,特点优应用范围广、灵敏度高、回收率好，不需昂贵仪器；缺操作费时，产生有害气体。,操作步骤准确称取样品0.50-2.00g(半固体2-5g，液体10-20m

5、L)于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4+0.5gCuSO4加20ml 浓H2SO4通风橱中先以小火加热泡沫消失后加大火力消化至透明无黑粒摇动瓶子(使瓶壁炭粒溶于硫酸中)继续消化30分钟至样液呈绿色透明；停止消化冷却加200ml水连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在凯氏瓶中加波璃珠数粒和80ml50%NaOH立即接好装置加热至到凯氏瓶内残液减少到三分之一时(200-250mL)，取出用水冲洗；用0.1mol/L HCl滴定(终点:蓝色微红)同时做空白实验：除不加样品外，从消化开始所有操作相同。,一、常量凯氏定氮法,计算公式,滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积,滴定空白消耗的标准盐酸溶液体积,盐酸标准

6、溶液浓度,样品的质量,蛋白质系数6.25,氮mol质量，14g/mol,所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全造成氮损失。样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口再蒸1分钟后关掉热源(避免造成吸收液倒吸)；吸收液中的混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,说明,二、微量凯氏定氮法,原理：与常量法同，3点区别：原理上蒸馏采用水蒸气蒸馏法；消化液只取一部分进行蒸

7、馏（常量法为全部）；装置不同。仪器和试剂、操作方法：P222说明蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数mL以使其始终保持酸性(避免水中的氨被蒸出)；蒸馏时蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽(否则将发生倒吸)；加碱要足量，加后漏斗迅速加盖，并应采用水封措施(避免氨逸出造成损失)。,实验课用到的微量法装置,1原理、仪器消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置、自动吸收和滴定装置及自动数字显示装置。2试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其它试剂同常量凯氏定氮法。,三、自动凯氏定氮法,凯氏定氮

8、法的优缺点,1）如何只测出蛋白质中的氮：样品可先在碱性条件下萃取蛋白质，然后用三氯醋酸或磺基水杨酸沉淀蛋白质。2）除凯氏定氮法和紫外分光法外：其他的所有方法对纯化蛋白质的测定都需要使用标准或参比蛋白质，而对于分析某一具体食品来源的蛋白质，选择适当的标准蛋白质非常重要。,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双缩脲法(Biuret法)原理在碱性条件下，Cu2+和肽类(如双缩脲、多肽和所有蛋白质)生成紫红色复合物（双缩脲反应），吸收波长为550560nm，比色法测得的吸光度值(OD值)与样品中的蛋白含量成正比。以标准蛋白质制作标准曲线，求出样品蛋白质含量。,脲,脲,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双

9、缩脲法(Biuret法)应用该法已被用于谷物、肉类、大豆及动物饲料的蛋白质定性测定。谷物样品(cereal chemistry,1961,38:467-479)双缩脲溶液：15mL氢氧化钾溶液（10mol/L）和2.5g酒石酸钾钠用900mL蒸馏水溶解，在持续搅拌下缓慢加入30mL五水硫酸铜溶液（4%），定容至1L。测定：标准曲线绘制：采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样品，按蛋白质含量40、50、60、70、80、90mg分别称取标准蛋白质样于6支50mL比色管，然后按照以上样品测定步骤，测定吸光度。,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双缩脲法(Biuret法)谷物样品测定：样

10、品测定：称取5005mg样品，加入2mL四氯化碳湿润样品，加入50mL双缩脲溶液，塞上瓶盖（铝或玻璃材料）在振荡器上振摇60min，然后4500转/min下离心15min；取上清液于550nm处读取吸光度。由标准曲线查出蛋白质的质量（mg），由此可计算出样品的蛋白质的含量。,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双缩脲法(Biuret法)豆类样品（Journal of Food Science，1965，30：307-311）双缩脲溶液：930mL蒸馏水+10mL氢氧化钾溶液（10mol/L）+20mL酒石酸钾钠溶液（25%），在剧烈搅拌下缓慢加入40mL硫酸铜溶液（4%CuSO45H2O）。测定

11、：称取0.10.2g样品于125mL锥形瓶中，加入2mL四氯化碳湿润分散样品，加入50mL双缩脲溶液，塞上瓶盖在振荡器上振摇15min，静置60min；然后4000转/min下离心10min；取上清液于550nm处读取吸光度。,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双缩脲法(Biuret法)肉类样品（Journal of Food Science，1964，29：168-174）测定：称取0.91.2g样品于含有20mLNaOH溶液（0.5mol/L）的50mL锥形瓶中，用玻棒搅拌分散，与沸水浴中加热10min，冰浴冷却；转于到50mL容量瓶中加水定容。用Whatman 3号滤纸过滤，吸取15mL

12、滤液于聚乙烯离心管中，加入1518mL无水乙醚，塞上塞子，充分振摇，于5820转/min离心，吸取1.0mL下层水相液体，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，于550nm处读取吸光度。,第三节 蛋白质快速测定方法,(一)双缩脲法(Biuret法)优缺点,(二)福林酚比色法(Lowry法)原理蛋白质与福林酚(Folin)试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜离子发生双缩脲反应，同时蛋白中存在的酪氨酸与色氨酸同试剂中的磷钼酸-磷钨酸反应产生颜色。呈色强度（750nm）与蛋白质含量呈正比，是检测水溶性蛋白含量的最灵敏的经典方法之一。,(二)福林酚比色法(Lowry法)方法1）将待

13、测的蛋白质样品稀释成合适的浓度(20100g)2）加入酒石酸钾钠-碳酸钠溶液3）冷却并在室温下放置10min后，加入硫酸铜-酒石酸钾钠-氢氧化钠溶液4）加入新配制的福林酚溶液，混匀，在50保温10min5）与750nm处比色读数6）建立标准曲线,(二)福林酚比色法(Lowry法)优缺点,(三)考马斯亮蓝比色法（Bradford布兰德福特法）原理考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色（蓝色），在595620nm出呈现最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。试剂牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配成100g/mL标准溶液。染料试剂：称取考马斯亮蓝G2

14、50 60mg，溶于100mL3%过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，储存于棕色瓶中备用。,测定吸取样品溶液2mL加染料试剂2mL混匀以介质溶液调零测定A620nm 查标准曲线，求出蛋白质含量。说明及适用范围已成功应用于测定麦芽汁、啤酒和马铃薯中的蛋白质含量。适用于可溶性蛋白质含量的测定本法快速、简单，适合大量样品测定，灵敏度与福林-酚法相近，但不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响。,优缺点,(四)280nm紫外吸收法原理由于蛋白质中存在含有共轭双键的的酪氨酸和色氨酸，因此具有紫外吸收性质，在280nm处，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度成正比，可定量测定。,特点优操作简便迅速；缺干扰多（非蛋白成分紫

15、外吸收；光散射作用）；在食品分析中应用不多。,试剂 标准蛋白质溶液(两种，任选其一)：牛血清蛋白标准液：称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，用水配成1mg/mL的蛋白质溶液。卵清蛋白标准液：称取经凯氏定氮法校正的卵清蛋白，用0.9%NaCl配成1mg/mL的蛋白质溶液。测定吸取1mL样品溶液加蒸馏水至4mL以蒸馏水调零测280nm处的吸光值A查标准曲线得样品蛋白质含量。说明本法测定与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，误差较大。,(五)水杨酸比色法原理样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色的化合物，在660nm处比色测定

16、，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。试剂氮标准溶液(1.0mg/mL，配制方法P230)：使用时稀释至2.50g/mL。空白酸溶液、磷酸盐缓冲溶液、水杨酸钠溶液、次氯酸钠溶液等(配制方法见课本),测定方法标准曲线绘制取6个25mL容量瓶加空白酸溶液2mL加磷酸缓冲液(控制适宜酸度)5mL加水至15mL加水杨酸钠溶液5mL37水浴15min加次氯酸钠溶液2.5mL37水浴15min取出于660nm比色绘制标准曲线。样品消化准确称样0.201.00g于凯氏瓶加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾加大火力消化出现暗绿色摇动瓶子至完全澄清冷却移至25ml容量瓶定容。测定准确吸取消化溶液10ml

17、于100ml容量瓶中定容准确吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同。并以试剂空白对照，测得样液的吸光度，从标准曲线查出其含氮量。计算,式中：c从标准曲线上查得的含氮量，g；K为样品溶液的稀释倍数；M为样品的质量，g；F为单换算为蛋白质的系数,说明样品消化后当天测定重现性好；显色与温度有关，严格控制温度。,(一)双指示剂甲醛滴定法(二)茚三酮比色法,第四节 氨基酸的测定,原理氨基酸具有酸性-COOH和碱性-NH2。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，碱性消失。用强碱标准溶液滴定-COOH，测定氨基酸总量。操作方法移取

18、含氨基酸约20-30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点(中和样液中其它酸性物质)；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液mL数。,(一)双指示剂甲醛滴定法,计算c为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1为用中性红指示剂滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积，ml;V2为用百里酚酞指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml;m为测定用样品溶液相当于样品的质量，g;0.014

19、为氮的摩尔质量，g/mol说明及注意事项此法简便快速，适用于测定食品中的游离氨基酸。发酵工业中常用于测定发酵液氨基氮含量；若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定；脯氨酸测定结果偏低；酪氨酸偏高；铵存在也使结果偏高。,原理 碱性条件下，氨基酸的氨基与茚三酮中的羰基缩合，生成蓝紫色化合物。可用比色法定量测定。试剂磷酸缓冲液(pH.8.04)、氨基酸标准溶液 2%茚三酮溶液称茚三酮1g溶于35mL热水加入40mg氯化亚锡(SnCl2H2O)(氯化亚锡有还原性，防止茚三酮氧化)搅拌过滤于冷暗处过夜定容至50mL,(二)茚三酮比色法,操作方法绘制标准曲线吸取标液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、

20、1.0 mL于6个25ml容量瓶加水+茚三酮试剂+缓冲液沸水浴加热15分钟(保证缩合显色反应充分)迅速冷却、定容静置15分钟 570nm下测吸光值绘制标准曲线。样品测定取澄清样品溶液1-4mL，按标准曲线操作，测定吸光值。注意事项 茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加1克活性炭(脱色)，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。,(二)茚三酮比色法,应用举例茶叶中游离氨基酸总量的测定（1）样品预处理 称取3g（准确至0.001g）磨碎

21、试样于500mL锥形瓶中，加煮沸的蒸馏水450mL，移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min摇动一次），浸提完毕后立即趁热减压过滤，残渣用少量热蒸馏水洗涤23次，将滤液转入500mL容量瓶中，冷却后用水定容。,(二)茚三酮比色法,应用举例茶叶中游离氨基酸总量的测定（2）样品测定准确吸取试液1mL于25mL比色管中，加入pH8.0磷酸盐缓冲液0.5mL和2%茚三酮溶液0.5mL，沸水中加热15min，冷却后加水定容至25mL，放置10min，用0.5cm比色皿于570nm处，以试剂空白溶液作仪器调零管，测定吸光度。（3）标准曲线绘制分别吸取1mL谷氨酸系列标准工作液（0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL）于25mL比色管中，后续操作同样品的测定。,(二)茚三酮比色法,