分子实验基本操作培训.ppt

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1、分子实验基本操作培训,Outline,分子实验基本流程介绍分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项总结,分子实验基本流程介绍,感受态的制备,PCR克隆目的片断,酶切及酶切片断回收（电泳）,连接,小提质粒并酶切鉴定（电泳）,大肠杆菌的培养,转化,分子实验基本流程介绍,感受态的制备,PCR克隆目的片断,酶切及酶切片断回收（电泳）,转化,连接,小提质粒并酶切鉴定（电泳）,大肠杆菌的培养,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,原理 大肠杆菌在37 下在较好较快的进行增殖，4 下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80 用15-20%甘油冻存）由于转入的质粒带有抗性标记，用带有抗生素的培养基即可进行选择

2、性培养。分为固体培养基培养和液体培养基培养,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,Step0:LB培养基的配制(1L培养基含)10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar(仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分)1L 去离子水一般一瓶配100-300mLStep0:灭菌（此后一切保持无菌操作）,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,固体培养基培养（用于筛选或短期保存菌种）Step1:倒板 微波炉加热培养基-室温冷却至60 左右-移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀释1000倍），摇匀-趁热快速倒入平板，12mL/板-超净

3、台内室温冷却凝固Step2:接种 划线法：烧红接种环-冷却-蘸上菌液-在平板上划线-灼烧接种环。多用于菌种保存 平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,固体培养基培养Step3：37培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时，防止突变株产生。Step4：培养结束后，需放入4 冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,液体培养基培养（用于扩增）Step1：取出适量培养液于锥形瓶或试管。Step2:加入适量抗生素。Step3：将目标菌落挑入

4、培养液。（可用接种环或枪头）Step4:将培养液放入37 摇床中培养，转速一般为220rpm。（为什么要摇？）,分子实验基本操作大肠杆菌的培养,注意事项：无菌操作！抗生素加入的时机及量培养时间（不可过长）返回,分子实验基本操作感受态的制备,原理：感受态-可接受外来DNA的状态 CaCl2法制备 Ca2+可以使膜骨架发生改变，产生膜 上的小孔洞，并可使DNA分子结合并进入细胞内。步骤：比较麻烦，属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备，因此不需经常进行。注意事项：感受态制备后应立即冻存于-80。使用时不可反复冻融。返回,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,原理：限制性内切酶：1）发现于细菌中，

5、用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致）3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。）分类：单切和双切,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,单切：Step1:酶切体系的选定 确定选用的酶-查找对应高效率的buffer（常用的buffer有H,M,L,K,T 五种），确定要不要加BSAH,M,L,K,T buffer 都有什么？H-High,M-Medium,L-Low,K-KCl,T-Tri-AcetateB-L,G-M,O-H,R-K,Tango-T,分子实验基本

6、操作酶切及酶切片断回收,Step2:配制酶切体系：以10uL体系为例 0.5uL 内切酶（含50%甘油防冻）1uL Buffer(10*)5uL 质粒 3.5uL 去离子水原则：1）甘油含量不可超过总体系5%，防止星火性 2）质粒可根据具体情况调整 3）内切酶切记不可置于常温！,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,Step3:置于37培养箱中，温育2-4h。（用水浴也可以，但可能会使溶液因蒸发而产生浓度不均匀）。注意有些特殊的酶所需的条件有所不同，主要是温度条件。Step4:纯化，方法同PCR片段纯化。Step5:电泳检测,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,双切：Step1:酶切体系的选定 确定选用的两种酶-查找对应双切的Buffer，同时看与分别单切的高效buffer是否吻合-确定要不要加BSAStep2:配制酶切体系。与单切类似，但需要注意酶的用量。（甘油含量不可超5%.）Step3:37温育2-4hStep4:凝胶回收,分子实验基本操作酶切及酶切片断回收,凝胶回收：即双切后将所需要的小片段重新富集纯化。Step1:电泳，电泳过程中称重一小离心管。Step2:电泳结束后，将凝胶置于成像仪内。Step3:戴上手套，持小刀，将小刀灼烧后冷却，隔着防护挡板，打开紫外，迅速将目标片段处凝胶切下。Step4:关闭紫外，称重，根据kit protocol进行余下试验。返回,