通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株.doc
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1、研 究 报 告doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.012通 过 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 改 造 CHO 细 胞 株付 玲 ,赵 兴 卉 ,郭 俊 伟 ,于 婷 ,宋 小 红 ,侯 利 华 ,陈 薇军 事 医 学 科 学 院 生 物 工 程 研 究 所 ,病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室(2004DAV00214),北 京 100071摘 要 目 的 :对 现 有 的 CHO-DG44 细 胞 株 进 行 改 造 ,得 到 在 无 血 清 培 养 基 中 更 具 生 长 优 势 的 CHO
2、 宿 主 细 胞 株 。 方法 :分 别 克 隆 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 基 因 ,构 建 共 表 达 2 种 基 因 的 pIRES 质 粒 ,转 染 CHO-DG44 细 胞 株 ,筛 选G418 抗 性 克 隆 。 结 果 与 结 论 :得 到 3 株 G418 阳 性 克 隆 株 ,其 中 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 表 达 水 平 最 高 的 S6 与CHO-DG44 相 比 ,在 无 血 清 培 养 基 中 生 长 更 快 、密 度 更 高 。关 键 词 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 ;代 谢 工 程 ;转 铁 蛋 白 ;细 胞 周
3、 期 蛋 白 D1中 图 分 类 号 Q813; Q78 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 1009-0002(2012)05-0676-04Construction ofOptimized CHO CellLinesbyOverexpression ofTransferrin and Cyclin D1FU Ling, ZHAO Xing-Hui*, GUO Jun-Wei, YU Ting, SONG Xiao-Hong, HOU Li-Hua, CHEN Wei*State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity(2004DAV002
4、14), Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China*Co-corresponding authors, CHEN Wei, E-mail: cw789661; ZHAO Xing-Hui, E-mail: zhao4workAbstract Objective: To optimize CHO-DG44 cell line for better performance in serum-free culture. Methods:Transferrin and cyclin D1 ORFs were inserted i
5、nto pIRES, then the construct was transfected into CHO-DG44cells. The cells were treated with G418 at a final concentration of 800 g/mL for selection. Results and Coclusion: Three CHO-DG44 cell lines overexpressing transferrin and cyclin D1 were obtained. The growth rate of oneof these three cell li
6、nes, S6, was significantly greater than CHO-DG44 during days 47 of suspension culture inserum-free medium. Our study proved that overexpression of cyclin D1 and transferrin could confer CHO-DG44with increased growth rate, and provided new candidate CHO cell lines for biopharmaceutical production.Key
7、 words Chinese hamster ovary cell; metabolic engineering; transferrin; cyclin D1中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞(Chinese hamster ovarycell,CHO 细 胞)表 达 系 统 因 具 有 准 确 的 转 录 后 修 饰功 能 ,且 表 达 的 糖 基 化 蛋 白 药 物 在 分 子 结 构 、理 化 性质 和 生 物 学 功 能 方 面 最 接 近 天 然 分 子 ,而 成 为 生 产 诸 如 抗 体 等 大 分 子 蛋 白 质 药 物 的 首 选 表 达 系 统 。 然 而 ,在 工 业 规
8、模 化 培 养 过 程 中 ,CHO 细 胞 常 遇 到 细 胞 生 长 缓 慢 、易 凋 亡 ,以 及 对 无 血 清 培 养 基 适 应 性 差 等 问 题 1。 为 了 刺 激 CHO 细 胞 的 生 长 ,需 要 在 无 血 清 培 养 基 中 添 加 胰 岛 素 样 生 长 因 子(IGF)和 转 铁 蛋 白 等 生 长 因 子 ,这 些 因 子 大 多 是 动 物 来 源 的 蛋 白 质 , 不 仅 费 用 高 昂 ,而 且 还 有 被 病 毒 污 染 的 潜 在 可 能 。利 用 代 谢 工 程 方 法 在 CHO 细 胞 株 中 高 表 达 某 些 重 要 基 因 ,可 以 使
9、 所 构 建 的 新 型 CHO 细 胞 株 在 一 定 程 度 上 克 服 上 述 局 限 ,更 适 应 产 业 化 规 模 培 养 的要 求 2。 例 如 ,共 表 达 IGF-1 和 Bcl-2 的 CHO 细 胞 株不 仅 对 恶 劣 培 养 环 境 诱 导 的 凋 亡 具 有 更 强 的 抵 抗 能力 ,还 可 以 通 过 自 分 泌 IGF-1,降 低 对 培 养 基 中 添 加IGF-1 的 依 赖 性3。 与 未 经 改 构 的 CHO 细 胞 株 相 比 ,共 表 达 存 活 素 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 的 CHO 细 胞 株 进入 S 期 的 比 例 增 加 56
10、%94% ,早 期 凋 亡 减 少 33%43% ,且 可 以 在 无 血 清 培 养 基 中 达 到 更 高 的 生 长 密度4;而 人 工 构 建 的 自 表 达 转 铁 蛋 白 和 IGF-1 的 CHO细 胞 株 甚 至 能 在 无 蛋 白 培 养 基 中 持 续 高 速 生 长5。我 们 通 过 在 CHO 细 胞 株 中 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1,构 建 了 在 无 血 清 培 养 基 中 具 有 生 长 优 势 的 CHO 宿 主 细 胞 株 。1材 料 与 方 法收 稿 日 期 :2012-02-06基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学
11、基 金(81025018,30570951)作 者 简 介 :付 玲(1961- ),女 ,高 级 实 验 师通 信 作 者 :陈 薇 ,(E-mail)cw789661;赵 兴 卉 ,(E-mail)zhao4work1.1 材 料CHO-DG44 和 CHO-S 细 胞 购 自 Invitrogen 公 司 ;CHO-K1 细 胞 、大 肠 杆 菌 DH5感 受 态 为 本 室 保 存 ;质 粒 pIRES 购 自 Clontech 公 司 ;pGEM-T 购 自 Promega 公 司 。HT、细 胞 贴 壁 培 养 所 用 的 MEM 培 养 基 及 悬 浮培 养 所 用 的 CHO-
12、S-SFM培 养 基 购 自 Invitrogen 公司 ;胎 牛 血 清(FBS)购 自 Hyclone 公 司 ;细 胞 转 染 试剂 LipofectAMINE 2000 购 自 Invitrogen 公 司 。转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 的 抗 体 、ECL 免 疫 印 迹底 物 购 自 Santa Cruz 公 司 ;辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的二 抗 购 自 中 杉 金 桥 公 司 。1.2 双 顺 反 子 表 达 载 体 pTID 的 构 建根 据 GenBank 序 列 BC092046 设 计 转 铁 蛋 白 基因 引 物 ,在 基 因 中 部 设 计
13、 Xho酶 切 位 点 ,分 成 2 部分 ,以 小 鼠 肝 脏 cDNA 为 模 板 扩 增 ,通 过 Nhe和 Mlu克 隆 入 pIRES;依 照 文 献 6 方 法 ,以 CHO-S 细 胞 系的 cDNA 为 模 板 扩 增 周 期 蛋 白 D1 基 因 序 列 ,通 过BamH和 Sal克 隆 入 pIRES。 引 物 见 表 1。PCR 扩 增 条 件 :94预 变 性 10 min,然 后 从 54开 始 每 5 个 循 环 退 火 温 度 增 加 2直 至 62,每 个 循环 72 延 伸 90 s,最 后 延 伸 7 min。 产 物 进 行 琼 脂糖 凝 胶 电 泳 ,从
14、 胶 上 切 下 各 约 1000 bp 的 片 段 ,连 接入 pGEM-T 载 体 ,测 序 。将 测 序 正 确 的 转 铁 蛋 白 2 段 基 因 分 别 用 核 酸 内切 酶 Nhe/Xho和 Xho/Mlu从 经 测 序 正 确 的 T载 体 中 切 下 ,连 入 经 Nhe/Mlu酶 切 的 连 有 正 确 的周 期 蛋 白 D1 基 因 序 列 的 载 体 中 ,选 取 酶 切 鉴 定 正 确的 质 粒 ,命 名 为 pTID(图 1)。1.3 CHO-DG44 细 胞 的 转 染 与 阳 性 克 隆 的 筛 选用 LipofectAMINE2000 将 pTID 转 染 CH
15、O-DG44细 胞 ,根 据 试 剂 说 明 书 操 作 。 以 终 浓 度 为 800 g/mL 的 G418 筛 选 阳 性 克 隆 。 铺 96 孔 板 ,挑 取 30 个G418 阳 性 克 隆 放 大 培 养 。1.4Western 印 迹 验 证 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 基 因在 CHO-DG44 细 胞 中 的 表 达细 胞 裂 解 物 的 提 取 方 法 及 Western 印 迹 方 法 参照 文 献4。1.5 无 血 清 培 养 基 中 细 胞 生 长 曲 线 测 定CHO-DG44 及 表 达 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 的 阳性 克 隆 在 含
16、HT 的 无 血 清 培 养 基 CHO-S-SFM中 培养 至 对 数 期 ,以 2000/孔 的 密 度 接 种 96 孔 板 ,每 孔 加入 200 L 上 述 无 血 清 培 养 基 。 每 天 每 株 细 胞 取 3孔 ,用 台 盼 蓝 染 色 ,计 数 活 细 胞 。2结 果2.1 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 基 因 的 克 隆由 于 以 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 等 3 株CHO 细 胞 的 cDNA 为 模 板 都 没 有 扩 增 到 转 铁 蛋 白 基因 ,于 是 便 以 小 鼠 肝 脏 cDNA 为 模 板 扩 增 。 在 基 因中 部 设
17、计 引 物 ,引 入 酶 切 位 点 Xho,分 成 2 段 分 别克 隆 ,PCR 结 果 如 图 2 所 示 。分 别 以 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 的 cDNA 为 模 板 ,扩 增 中 国 仓 鼠 周 期 蛋 白 D1 基 因(图 3)。与 CHO-DG44 一 样 ,CHO-S 也 是 购 自 Invitrogen 公司 的 商 品 化 细 胞 ,由 细 胞 株 CHO-K1 驯 化 而 来 ,因 此是 dhfr 非 缺 陷 型 细 胞 ,可 在 无 血 清 培 养 基 CHO-S-SFM中 悬 浮 生 长 。 该 细 胞 株 与 CHO-DG44 相 比虽 然
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- 通过 表达 铁蛋白 细胞周期 蛋白 D1 改造 CHO 细胞株
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