目录 实验一 蛋白质的吸光分析测定.doc

《目录 实验一 蛋白质的吸光分析测定.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《目录 实验一 蛋白质的吸光分析测定.doc（55页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、目 录实验一 蛋白质的吸光分析测定吸光分析法的原理与仪器一、 改良Lowry 比色法（Hartree法）二、 考马斯亮蓝结合法三、 紫外分光光度法实验二 酶促反应动力学实验一、 pH对酶促反应速度的影响二、 温度对酶促反应速度的影响三、 底物浓度对酶促反应速度的影响 （碱性磷酸酶Km值的测定）四、 抑制剂对酶促反应的影响实验三 氨基酸代谢实验一、 肝脏谷丙转氨酶活性测定二、 联合脱氨基作用的检定等温蒸馏定氨法实验四 肝糖原实验一、 肝糖原的提取和定量二、 饱食、饥饿和激素对肝糖原含量的影响实验五 细胞培养技术实验六 细胞与细胞核的分离技术一、 细胞的分离技术二、 细胞核的分离与纯化实验七 真核

2、细胞DNA的提取实验八 快速抽提质粒实验九 血清蛋白电泳一、 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳定量二、 聚丙酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质三、 血清蛋白质的凝胶等电聚焦电泳四、 血清脂蛋白琼糖凝胶电泳实验十 血液成分测定血液样品的制备一、 血液葡萄糖测定二、 血液尿素氮测定-二乙酰一肟法三、 血清总胆固醇测定前 言生物化学的迅速发展，在很大程度上有赖于生物化学实验技术的进步。许多生化理论成果，如果不了解其实验研究过程，是难以得到深刻的理解与牢固的掌握。因此，学生在学习生物化学理论的同时，应该对生物化学实验技术有所了解与掌握。生物化学实验技术发展很快，种类很多，要在短时间内全面掌握是不现实的。但是学生能

3、对一些常用的基本生化实验方法，通过亲自的操作而有所认识，显然会有助于生化理论的学习与理解。并为将来进一步开展医学研究工作奠定基础。为此，我们选择了一些常用生化实验方法，供学生操作，其中包括了生化实验技术的各个方面，以定量实验为主，特别注重了医学生化技术的基本原理，希望学生通过这些实验的全过程训练后，能够从多方面理解这些技术的意义及用途，能对这些生化技术有比较全面的认识。随着生物化学的发展，分子生物学实验技术也越来越多地应用到生化的研究领域。我们在本次编写的实验指导中增加了一些分子生物学的实验方法，目的是让学生对分子生物学实验有所了解，同时，对生物化学研究发展方向也有所知晓。由于受学时数的约束，

4、我们未能把生物化学所有的实验技术都编入其中，只局限于一部分对医学生学习生化可能会有帮助的实验。另外，限于我们业务技术水平等原因，本实验指导可能有一些缺点和不够完善之处，敬请批评、指正。 编者 20075不迟到早退。实验一 蛋白质的吸光分析测定蛋白质是生物体的主要组成成分，也是生命活动的主要物质基础，体内的酶、受体、凝血因子、免疫球蛋白等都是蛋白质。因此，不论是生物化学、免疫学、药理学、微生物学等医学各基础学科，还是临床检验及临床各科的研究工作，都必须把蛋白质含量测定作为一项基本的实验手段，随着医学科学的不断发展，蛋白质测定方法的应用还会更广。测定蛋白质含量的方法很多，基本上都是根据蛋白质的物理

5、、化学或者生物学特征而建立的。目前常用的方法主要有根据蛋白质结构或组成的紫外光吸收特征而建立的紫外分光光度法和根据蛋白质与不同试剂起颜色反应或与色素结合，而比色测定其含量的比色法。不论是紫外分光光度法，还是比色法均要使用分光光度计。因此，首先要介绍一下吸光分析的原理与仪器。吸光分析法的原理与仪器吸光分析是生化实验中最常用的实验方法。光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长，肉眼可见彩色光称为可见光，波长范围在400750，小于400的光线称为紫外线，大于750的光线称为红外线。吸光分析所依据的是Lambert和Beer定律。（一）Lambert定律：一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分

6、，被吸收光的多少与溶液介质厚度有一定比例关系。即：式中Io为入射光强度。I为通过溶液介质后的光强度，L为溶液介质的厚度，K为吸光系数。（二）Beer定律：一束单色光通过透明溶液介质时，若溶液介质厚度不变，被吸收光的多少与溶液介质浓度有一定比例关系。即：式中C为溶液介质的浓度。上述两式合并可得：令则 A=KCL或A= logT式中A为吸光度，T为透光度。此式即为Lambert-Beer定律的物理表示式。其含义为：一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度与厚度成正比。此式即为吸光分析法的基本计算式。在实际使用分光光度计时，通常是把溶液厚度固定的，因而可直接测定吸光度来求得溶

7、液介质的浓度。平常要测定一个待测样品的同时，常把一个已知浓度的标准品（与待测样品性质相同），配制成不同的浓度，测定其相应的吸光度，画出以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标的标准曲线（或叫工作曲线）以此查得未知样品的浓度，还可按照下列公式，对未知样品的浓度通过计算得出： 仪器吸光分析法常常采用的仪器是分光光度计，其主要型号有722型分光光度计和752型紫外分光光度计等。现将它们的组成、方法介绍一下：1 722型分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。结构如图11所示。图11 722型分光光度计结构示意图使用方法：使用仪器前，使用者应先了解本仪器的结构、工作原理以

8、及各个操作旋纽的功能。接通电源，打开电源开关，指示灯亮。选择开关置于“T”，选择好使用波长，仪器预热20分钟。打开试样室盖（光门自动关闭），调节“O”旋钮，使数字显示为“00.0”盖上试样室盖，将比色皿架处于空白校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。如果显示不到“100.0”，则可适当提高灵敏度（即将灵敏度旋钮由“1”到“2”档）。若灵敏度改变了，仪器的“00.0”和“100.0”需重新校正。预热后，即可进行测定工作，将选择开关置于“A”，调吸光度调零旋钮，使数字显示为“00.0”，然后将被测样品移入光路，显示的数据即为被测样品的吸光度值，记录之。若比

9、色测定完毕，将比色液取出弃之废液缸内，洗净比色皿放回原处，仪器选择开关回到“T”，关掉电源。2 752型紫外分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。其工作原理如图12所示：TAC试样室图12 752型紫外分光光度计结构示意图使用方法：先接通电源，按电源开关（开关内2只指示灯）。钨灯点亮；按“氢灯”开关（开关内左侧指示灯亮）；氢灯电源接通，再按“氢灯触发”按纽（开关内左侧指示灯亮）；氢灯点亮。仪器预热30分钟。预热后，将选择开关置于“T”选择所需的波长，打开试样室盖，调节“0%（T）”旋钮，使数字显示“00.0”，将比色液装于石英比色皿中，再放入比色架上，

10、盖上样品室盖，将参比溶液置于光路，调节透过率“100”旋钮，使数字显示为“100.0%”（T）若不到100.0%（T）则可适当增加灵敏度的档数。并重新调“00.0”和“100.0%”。再将选择开关置于“A”，旋动吸光度调整旋钮，使得数字显示为“00.0”。将被测液置光路中，显示值即为试样的吸光度值，并记录之。使用完毕后，将选择开关置于“T”，取出比色液弃之，洗净放回原处，关掉电源开关。一、 改良Lowry 比色法（Hartree法）原理本法主要是利用酚试剂显色。酚试剂中的主要成分是磷钼酸和磷钨酸，蛋白质分子中的胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸均能使它们失去1个、2个或者3个氧原子，还原成含有多种

11、还原型的的混合酸，具有特殊的蓝色。由于蛋白质肽键在碱性条件下发生烯醇化反应，能使铜离子螯合在肽结构中，形成复合物，从而使电子易于转移到酚试剂上。这样大大地增强了酚试剂对蛋白质的敏感性。利用蓝色深浅与蛋白质浓度的关系，可制备标准曲线，测定样品中蛋白质的含量。（反应如下：）操作1 标准曲线的制备：取蛋白标准血清（浓度为：蛋白7g/dl）。用生理盐水配制成一系列不同浓度的蛋白标准溶液。液：先将标准血清用生理盐水500倍稀释。液：取液7.5ml加生理盐水稀释至10ml，为667倍稀释液。液：取液5.0ml加生理盐水稀释至10ml为1000倍稀释液。液：取液5.0ml加生理盐水稀释至10ml为2000倍

12、稀释液。液：取液5.0ml加生理盐水稀释至10ml为4000倍稀释液。另取6支试管编号，用一支1ml的吸管从稀到浓，吸取上述稀释好的标准液置试管中，按下表操作编号123456蛋白质浓度g/ml17.535701051400标准溶液（ml）1.01.01.01.01.0生理盐水（ml）1.0试剂A（ml）0.90.90.90.90.90.9混匀后置于50水浴10分钟，冷却试剂B（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混匀放置室温10分钟试剂C（ml） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0立即混匀，置50水浴中保温10分钟，冷却后比色，在分光光度计上以波长650nm比色，

13、以第6管为空白管调零，读取其他各管吸光度。以各标准溶液浓度为横坐标，各管的吸光度为纵坐标作图，得标准曲线。标准曲线必须从零点出发，最好能成一直线，绘好后应注明所用仪器的型号及编号、波长、测定方法、曲线名称与制作日期。2 蛋白质样品的测定取试管2支，按下表操作 试管试剂测定管空白管未知样品（ml）1.0生理盐水（ml）1.0试剂A（ml）0.90.9混匀后在50水浴保温10分钟，冷却试剂B（ml）0.10.1混匀，放置室温10分钟试剂C（ml）3.03.0立即混匀，置50水浴中保温10分钟，冷却后，在分光光度计中，以650nm波长比色，读取吸光度。再查标准曲线，求得未知样品中蛋白含量，以mg/m

14、l为单位。试剂1. 试剂A 称取酒石酸钾钠2g及Na2CO3100g溶于500ml 1.0mol/L NaOH溶液中，再用水稀释至1000ml。2. 试剂B 称取酒石酸钾钠2g及CuSO4.5H2O 1g，分别溶于少量水中，混匀后加水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。3. 试剂C 市售的酚试剂按1:15倍稀释即可。自配：称取Na2WO42H2O100g，Na2MoO42H2O25g溶于700ml水中，加入85%H3PO4 50ml，浓HCL100ml，混匀后置圆底烧瓶中回流10h，加入硫酸锂（Li2SO4H2O）150g，水50ml及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去余溴，冷

15、却后稀释至1000ml，过滤溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存临用时1:15稀释即可。4. 0.9 NaCl注意事项1 测定蛋白质的浓度最好在15110g范围内，如样品蛋白浓度过浓，应稀释后再测定。2 各管在加酚试剂时必须快速，立即混匀，不应出现混浊。二、 考马斯亮蓝结合法原理考马斯（Coomassie）亮蓝能与蛋白质的疏水区相结合。这种结合具有高度敏感性。考马斯亮蓝G250磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰为595nm。在一定范围内，Coomassie亮蓝G250蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白

16、质含量的测定。操作1 标准曲线制备配制1mg/ml的标准牛血清蛋白溶液。制备一系列稀释液，其浓度分别为500g/ml 250g/ml 125g/ml 62.5g/ml 31.25g/ml。再按下表操作：（取六支试管编号）管号123456蛋白质含量（g/ml）50025012562.531.250标准溶液（ml）0.10.10.10.10.1生理盐水（ml）-0.1染液（ml）555555摇匀，室温静置3分钟。以第六管为对照管，于波长595nm处比色，读取吸光度，以各管吸光度为纵坐标，各标准液浓度（g/ml）为横坐标作图得标准曲线。2 未知样品测定取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生

17、理盐水至刻度，摇匀。（此样品稀释200倍）取试管2支，按下表操作：测定管对照管稀释样品（ml）0.1生理盐水（ml）0.1染液（ml）5.05.0混匀。室温静置3分钟，于波长595nm出比色，读取吸光度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白浓度。未知血清蛋白质浓度（g/ml）稀释样品浓度稀释倍数试剂10.9NaCl2标准蛋白：称取100mg牛血清蛋白，加生理盐水溶解并稀释至100ml（容量瓶配制）。3 染液：称取考马斯亮蓝G250 0.1g溶于50ml 95%乙醇，再加入100ml 85%(W/V)磷酸，然后加蒸馏水稀释至1000ml。注意事项1 待测样品蛋白的浓度含量应在50400ug为宜。2 该法

18、简便，灵敏度高，但显色深浅仍受环境酸碱度影响。3 若样品中存在大量十二烷基硫酸钠（SDS）等去垢剂时，显色反映也会受到干扰。三、 紫外分光光度法原理蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，故可以利用280nm波长的光吸收程度（即吸光度）来推测蛋白质含量。由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm波长处，如同时测定280nm和260nm波长的吸光度，通过计算可消除核酸对蛋白质测定的影响。操作1 稀释血清（或其他蛋白质溶液）：准确吸取0.1ml血清置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。（为500倍稀释）

19、2 测定吸光度：在紫外分光光度计上，将稀释的蛋白质溶液盛于石英比色杯中，以生理盐水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度。计算将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。蛋白浓度（mg/ml）1.45A2800.74A260注意事项1 不同的蛋白质及核酸的光吸收率不完全相同，按上述经验公式计算仍可产生较大误差。同时，该方法适用样品中核酸含量必须20%；A280/A2601.5。2 本法对微量蛋白质的测定既快又方便。它还适用有硫酸铵或其它盐类混合的蛋白质样品，如用其他方法测定往往比较困难。3 该法最大的优点是蛋白质样品中不需加任何化学试剂，故可保存蛋白质生物学

20、活性，即样品可回收。4 如纯蛋白样品，可根据该蛋白在280nm附近的标准吸光系数，直接测定该蛋白含量。 如牛血清的蛋白的为6.3，则待测样品中牛血清的蛋白含量可用下列公式计算：思考题1 改良Lowry法测定蛋白质并不等于酚试剂法，试从原理上说明之。2比较本次实验三种不同的蛋白质测定方法，各有何优缺点？实验二 酶促反应动力学实验酶促反应动力学主要研究酶催化反应的过程与速度，以及各种影响酶催化速度的因素，定量地加以阐述。定量时的观察对象是单位时间内底物的减少或产物增加的量。因为酶具有高度不稳定性，反应体系的条件必须严格控制，这些条件包括pH、温度等。如果能正确的选择和维持这些实验条件，那么酶量和反

21、应速度之间的关系就可以掌握。酶催化反应典型曲线是随着时间的延长，反应速度下降。由起初线性部分转变成曲线。这种变化是由于几种因素的共同作用而产生的。包括底物浓度下降，逆反应增加和酶的变性等。用不同量的酶进行实验时，起初线性部分斜度与酶浓度成正比，而非线性部分则不是这样，因此测定酶活性的所有反应速度的比较都必须依赖于线性部分。也就是说要测定最初反应速度。在酶促进反应动力学实验过程中，对不同因素的研究所需的底物浓度也不同。例如在测定底物浓度、抑制剂、激活剂对酶活性的影响时，选择的一系列底物浓度，一般均在其Km值左右。而在测定pH、温度对酶活性影响时选择的底物一般是其Km的10倍左右。本实验以碱性磷酸

22、酶为例研究pH、温度、底物及抑制剂对该酶的影响，酶反应速度则利用比色法测定单位时间内产生的产物量来推断。一、 pH对酶促反应速度的影响原理酶促反应对于环境的酸碱度非常敏感，每一种酶只有在一定的pH时才表现其最强的活性，此时的pH称为最适pH，不同的酶，最适pH也不同，同一种酶作用于不同底物时其最适pH也可不同，环境的pH偏离最适pH将引起酶活性的降低，酶促反应速度的下降。本实验通过不同pH下碱性磷酸酶活性的改变，说明最适pH的概念及碱性磷酸酶最适pH的大致范围。碱性磷酸酶（AKP）的专一性较差，能水解多种磷酸酯，但对于不同的底物，其最适pH不同，本实验采用磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后则

23、产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌类衍生物。根据红色的深浅就可测出酚的含量，从而计算出酶的活性大小。操作1 取试管六支，编号按下表操作管号123456pH值pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.0甘氨酸缓冲液（ml）0.90.90.90.90.9蒸馏水（ml）0.90.01mol/L基质（ml）1.01.01.01.01.01.0混匀，37水浴保温5分钟酶液（ml）0.10.10.10.10.1pH8.8Tris缓冲液（ml）0.1立即混匀，计时，37水浴保温15分钟 保温结束后，各管中先加入NaOH终止反应，然后再加入其他试

24、剂0.5mol/LNaOH (ml)1.01.01.01.01.01.00.34-氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.00.5铁氰化钠（ml）2.02.02.02.02.02.0立即混匀，使显色完全，室温放置10分钟2. 用肉眼比较各管颜色深浅，分别用表示。观察何种pH值下酶活性最强，并记录。试剂1. 甘氨酸缓冲液：称取15.0g甘氨酸加蒸馏水溶解并稀释至1000ml即为0.2mol/L甘氨酸溶液。于50ml0.2mol/L甘氨酸溶液中按下表加入0.2mol/LNaOH，最后加蒸馏水至110ml，即可配成不同pH值的甘氨酸缓冲液。pH0.2mol/L甘氨酸（ml）0.2mol

25、/LNaOH(ml)8.09.010.011.012.050.050.050.050.050.01.08.832.048.5552. 0.01mol/L基质液：称取磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2 2H2O）3.79g或磷酸苯二钠（无结晶水）2.18g，用水溶解并稀释至1000ml。加4ml氯仿防腐，置棕色瓶，冰箱内保存。此液只能用一周。3酶液：称取纯制的碱性磷酸酶2.5mg，用pH8.8Tris缓冲液配制成100ml，冰箱中保存。40.5mol/L NaOH50.34氨基安替比林：称取4氨基安替比林0.3g及碳酸氢钠4.2g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。置棕色瓶，冰箱内保存。60.4铁氰

26、化钾：称取5g铁氰化钾和15g硼酸，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混匀，再用蒸馏水稀释至1000ml，置棕色瓶，避光保存。7. pH8.8Tris缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml即为0.1mol/L Tris溶液。 取0.1mol/L Tris溶液100ml，加蒸馏水800ml，再加入0.1mol/L醋酸镁100ml，混匀后用1醋酸调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000ml即可。8. 0.1mol/L醋酸镁：称取醋酸镁21.45g，溶解于蒸馏水并稀释至1000ml。9. 酚标准液及标准曲线的制备称取结晶酚1.5g，溶于0.1mol/

27、L盐酸至1000ml，为储备液。标定：取25ml上述酚液，加55ml 0.1mol/LNaOH后加热至65C，再加入0.1mol/L碘液25.0ml，盖好放置30分钟后，加浓盐酸5ml，再以0.1淀粉为指示剂，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定。反应式如下：根据反应，3分子碘（分子量为254）与1分子酚（分子量为94）起作用，因此每ml0.1/L碘溶液（含碘12.7mg）相当于酚的g数为：25ml碘液中被硫代硫酸钠滴定作用的体积为Xml，则25ml酚溶液中所含酚量为：（25X）1.567mg应用液按上述标定结果用蒸馏水稀释成0.1mg/ml作酚标准液。制备标准曲线：取试管六支，按下表操作：管号1

28、23456酚标准液0.1mg/ml（ml）0.050.10.20.30.4蒸馏水（ml）2.01.951.91.81.71.6混匀，在37水浴保温5分钟保温结束后，各管中先加入NaOH终止反应，然后再加入其他试剂0.5mol/L NaOH（ml）1.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.00.5铁氰化钠（ml）2.02.02.02.02.02.0混匀，室温放置17分钟后，以510nm波长比色，绘制标准曲线酚含量（g/ml）0510203040二、 温度对酶促反应速度的影响原理温度对酶活性有显著的影响。温度低时，酶促反应减弱或停止；温度从较

29、低逐渐升高时，反应速度也随之逐渐增加；当温度上升到某一定值时，酶促反应速度达到最大值，此温度称为酶作用的最适温度。但酶是蛋白质，其本身也因温度升高而变性，超过最适温度时，反而使酶促反应降低，一般温度升至7080C以上，酶活性几乎全部丧失。应该指出，体外实验时酶的最适温度会随着保温时间的长短而有所变化。本实验以碱性磷酸酶为例，在不同温度下保温一定时间，观察酶活性变化。操作取试管五支编号，按下表操作管 号1234空白0.1mol/LpH10碳酸缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.01mol/L基质（ml）1.01.01.01.01.0保温温度（5分钟）冰浴室温37100酶液（ml）0.

30、10.10.10.1pH8.8Tris缓冲液（ml）0.1保温温度（15分钟）冰浴室温37100室温保温结束后，各管中先加入NaOH终止反应，然后再加入其他试剂立即加0.5mol/L NaOH(ml)1.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.00.5铁氰化钾（ml）2.02.02.02.02.0充分混匀，室温放置10分钟。用肉眼比较各管颜色之深浅，用表示。并判断，何种温度下酶活性最强，作记录。试剂1. 0.1mol/LpH10碳酸缓冲液：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水并稀释至1000ml。2. 其它试剂同前。三、 底物浓度

31、对酶促反应速度的影响 （碱性磷酸酶Km值的测定）原理在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度S的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值（即最大速度Vm）。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示（Michaelis-Menten方程）即： 式中Km为米式常数，Vm为最大反应速度，当v=Vm/2时，则Km=S，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确

32、求得Km和Vm。若将米氏方程变形为双倒数方程（Lineweaver-Burk方程），则此方程为直线方程,即以1/V和1/S分别为横坐标和纵坐标。（如图21所示），将各点连线，在横轴截距为1/Km，据此可算出Km值。 图21 酶反应速度倒数与底物浓度倒数的关系曲线本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/S的倒数作图，计算出其Km值。操作1 取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度： 管号试剂0.01mol/L基质液(ml)011111123蒸馏水（ml）3765432202 另取9支试管编号，按下表操作 管号试剂123456789吸取稀释后基质液1.

33、0mlpH10碳酸钠缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37水浴保温5分钟酶 液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最终基质浓度（mM）S010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液，立即计时，各管混匀后在37准确保温15分钟保温结束后，各管中先加入NaOH终止反应，然后再加入其他试剂0.5mol/L NaOH(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5铁氰化钾（ml）2.02.02.02

34、.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置室温10分钟，以1管为对照于510nm波长处比色，读取各管吸光度，做记录，酶活性计算及Km值计算1 在37C下保温15分钟产生1g酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（g），以此计算出各管的酶活性（v）。2 以酶活性单位（v）的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度S的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点并连接成线，求酶的Km值。试剂同前实验。四、 抑制剂对酶促反应的影响原理凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，称为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两大类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用

35、特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反应的最大速度Vm值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响S与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vm。本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。操作1 取试管9支编号，按下表操作： 管号试剂0.01mol/基质（ml）011111123蒸馏水（ml）3765432202 另取9支试管编号，按下表操作 管号试剂123456789吸取稀释基质液1.0ml0.04mol/L磷酸氢二钠（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）0.80.80.80.80.80.80.80.

36、80.8混匀，37水浴保温10分钟左右酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最终基质浓度(mM)S010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液，立即计时，各管混匀后在37保温15分钟保温结束后，各管中先加入NaOH终止反应，然后再加入其他试剂0.5mol/L NaOH(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5铁氰化钾（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.0充分混匀，放置室温10分钟，以1管为对照于51

37、0nm波长比色，读取各管吸光度，并计算各管酶活性（v）。作图以酶活性单位（v）的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度S的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。（可在一张坐标纸上作图，以便比较）判断该抑制作用属于哪种类型。试剂10.04mol/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠14.3g溶解于0.1mol/LpH10的碳酸缓冲液中并稀释至1000ml。2其它试剂同前实验。注意事项1 该实验所有的玻璃器材必须清洁，以免污染物影响酶的活性。2 在做该实验时，要保证条件的一致性，如研究温度对酶促反应速度的影响，在时间的控制上尤为重要，否则，结果难以

38、解释。思考题1 除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？2 为什么进行此种酶动力学测定时，所用各底物浓度不是按等差递增？3 酶动力学实验中，哪些因素需严格控制？实验三 肝糖原实验实验四 氨基酸代谢实验在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。此过程可用下式表示：本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，除分别测定谷丙转氨酶（Glutamate-pyruvate transaminase，GPT）及谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase,GDH）活性外，又通过抑制剂观察了肝组织中的联合脱氨基

39、作用。 一、 肝脏谷丙转氨酶活性测定 原理在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。此反应可逆，平衡点近于1。无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定所生成的酮酸，因此可有多种测定方法。 本实验以丙氨酸及酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测所生成的丙酮酸的量来确定其酶活性。丙酮酸能与2,4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸2,4二硝基苯腙。后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的吸收峰为439530nm，可用于测定丙酮酸含量。 酮戊二酸也能与2,4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中

40、吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙稍有差别，在520nm波长比色时，酮戊二酸硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转氨基作用后，酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与酮戊二酸的mol比基本上呈线性关系，故可籍以测定谷丙转氨酶活性。 但是，由于在实验中不宜过多的酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶量之间的关系并不始终呈一直线关系。当酶量增大时，曲线斜率减小。因此在测定时，如酶活性较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。另外2,4-二硝基苯肼对

41、此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加酮戊二酸，丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。操作1 匀浆制备：（1） 将小白鼠处死，立即取出肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，取肝脏0.5g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入4.5ml预冷的pH7.4，0.1mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存，以备进行下列各实验。（2） 取上述肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的pH7.4，0.1mol/L磷酸缓冲液9.9ml（稀释100倍）摇匀，即为稀释肝匀浆。 2. 谷丙转氨酶活性测定：（1）取试管2支，分别注明“测定管”、“对照管”，按下表操作： 测定管对照管 谷丙转氨酶底物（ml）0.5 37预温5分钟稀释肝匀浆（ml）0.10.1混匀后，37水浴准确保温30分钟2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.5谷丙转氨酶底物（ml）0.5 混匀后，37水浴中继续保温20分钟0.4mol/LNaOH(ml)5.05.0（2）混匀后，静置10分钟，于520nm波长处进行比色。以蒸馏水为空白，读取测定管与对照管的吸光度，将测定管吸光度减去对照管吸光度，然后从标准曲线查出其相当的丙酮酸