第二章 发酵液预处理.doc

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1、第二章 发酵液的预处理和固液分离技术2.1 发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝

2、体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。 预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。如果所需的产物为细胞，离

3、心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。图11为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。 图11 生化产品分离纯化的一般步骤12.1.1 预处理简述 发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。同时，发酵液中的部分杂质也得以去除。发酵液的预处理过程一般包括以下几部分：（1）发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。（2）改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵液的粘度，调节适宜的pH值和温度1及絮凝与凝聚等操作来实现。预处理在

4、生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。目的产物不同，采用的预处理方法也不同。并且，由于具体发酵液的实际情况差别很大，预处理方法就更加灵活，多样，应根据生产需要进行选择和改进。发酵液预处理之后，再进行固液分离，进入后续的分离纯化工艺。2.1.2 发酵液杂质的去除发酵液成分复杂，目的产品与许多溶解的和悬浮的杂质夹杂在一起。在这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。在采用离子交换法提炼时，高价无机离子，尤其是Ca2+ 、Mg2+ 、Fe3+的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。而杂蛋白，一方面，在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低吸附能力，另一方面，在采用有机溶剂或两水相萃取

5、时，常有乳化现象，使两相分离不清。除此之外，在常规过滤或膜过滤时，杂蛋白还会使滤速下降，污染滤膜。因此，在预处理时，应尽量除去这些杂质。2.1.2.1 无机离子的去除由于培养基或水中含有无机盐，发酵液中往往存在许多无机离子，如Mg2+、Ca2+等，因而需要经常测定并除去无机离子。去除的方法比较固定，因此，在这方面的研究也比较少。2.1.2.1.1钙离子的去除在发酵液中加入草酸，可除去钙离子2，同时草酸可酸化发酵液，使发酵液的胶体状态改变，并且有助于产物转入液相。由于草酸的溶解度较小，用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。但是，草酸的价格较高，如果

6、回收利用可以降低成本。例如：在四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60下反应生成草酸铅，草酸铅在9095下用硫酸分解，再经过过滤、冷却、结晶操作后就可以回收草酸。此外，在沉淀钙离子的同时，草酸还会与发酵液中的镁离子形成草酸镁，去除部分镁离子。2.1.2.1.2 镁离子的去除一般来讲，草酸等弱酸的镁盐溶解度较大，并且发酵液中镁离子的浓度通常不高，利用草酸沉淀很难去尽镁离子。可以加入三聚磷酸钠，三聚磷酸钠与镁离子形成的络合物可溶，即可消除对离子交换树脂的影响：Na5P3O10 + Mg2+ = MgNa3P3O10 + 2Na+用磷酸盐处理，也能大大降低发酵液中钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸

7、的提炼。2.1.2.1.3铁离子的去除发酵液中铁离子，一般用黄血盐去除，使其形成普鲁士兰沉淀：3K4Fe(CN)6 + 4Fe3+ = Fe4Fe(CN)63+ 12K+2.1.2.2 可溶性蛋白质的去除及其生化机理在发酵液中除了上述高价无机离子外，还存在可溶性杂蛋白。一般来讲，对于无机或有机酸、碱及其金属盐类，在特定条件下，通过溶媒转向、离子交换等方法可使其与产物逐步分离。但对于可溶性杂蛋白，如果任其进入滤液，将给以后各步的分离精制工作带来极大的不便。因此发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程。在各种方法中，变性沉淀最为常用。正确认识蛋白质的性质

8、和变性理论很重要，因为它是发酵液预处理所依据的生化机理3。2.1.2.2.1 盐法水溶性蛋白质溶液是胶体体系，分子与水有很大的亲和力，所以又是亲水胶体，具有一般胶体体系的动力学和电学性质。它的溶解度与其分子高度水化有关，所以溶解的蛋白质分子周围有水化层。水化层是胶体体系稳定的必要条件之一。如果向胶体系统中加入电解质，随着体系的离子强度增大，蛋白质表面的双电层厚度就会降低，静电排斥作用减弱，同时也使得蛋白质某些疏水区的水化层脱落，疏水区域暴露，容易发生凝聚，从而沉淀。水溶液中的蛋白质，其溶解度一般在生理离子强度范围内（0.150.2mol/kg）最大，低于或高于此范围时均降低。蛋白质的盐析行为随

9、着蛋白质的相对分子量和立体结构的不同而异，结构不对称的高相对分子量蛋白质所需的盐浓度较低，对于特定的蛋白质，影响盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果比较好，含高价离子的盐比11价型盐的盐析效果好。从成本和溶解度的角度考虑，硫酸铵是使用最普遍的盐析盐，但也有缓冲能力差，pH值不易准确控制的缺点。除硫酸铵外，硫酸钠和氯化钠也常用于盐析；除盐的种类外，盐析操作的温度和pH值对盐析效果也有着重要的影响。一般而言，在高离子强度下，升高温度，蛋白质溶解度降低；对于pH值而言，在接近蛋白质等电点时，有利于盐析。2.1.2.2.2 等电点沉淀法蛋白质是由许

10、多氨基酸分子按一定的方式互相连接而成的。氨基酸是有机羧酸分子中碳链上的一个或几个氢原子被氨基取代生成的化合物。各种氨基酸在蛋白质分子中互相连接时，总有一些自由的羧基和自由氨基，其结构可以用通式表示：这种结构表明它是一种两性电解质。羧酸解离时产生H+，使蛋白质具有弱酸性：蛋白质的氨基能与H+结合成RNH3+，使其具有弱碱性：蛋白质质点所带电荷，可因溶液pH值的变化而变化。它在酸性溶液中带正电，反之带负电。当溶液处于某一pH值时，蛋白质质点所带的净电荷恰好为零，此时的pH值就称为蛋白质的等电点。处于等电点状态时，蛋白质之间的静电排斥力最小，因此它失去了作为胶体体系稳定的基本因素。此时蛋白质质点迅速

11、结合成聚集体，极易沉淀析出。在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的pH值调至23的偏酸性范围或89的偏碱性范围内，使蛋白质变性沉淀。等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行，一般蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，多通过加入无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）调节pH值完成等电点沉淀。等电点沉淀法一般多用于疏水性较大的蛋白质。对于亲水性很强的蛋白质，由于在水中的溶解度较大，在pH值为等电点的环境下不易产生沉淀，所以盐析沉淀法应用更为广泛。与盐析法相比，等电点沉淀法省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀操作的pH值较低时，杂蛋白更容易变性，所以该方法仍是蛋白质初级分离的有效手段。由于极端pH值会导

12、致某些目的产物失活，并且需消耗大量的酸碱。因此，采用调节pH值实现等电点沉淀有一定的局限性。2.1.2.2.3 加热法热敏性是蛋白质的一个显著特性，有些蛋白质在50即失去活性而变性。一般的蛋白质在7080则不可逆的变性析出。对一些目标产品而言，如果其本身的耐热能力超过了加热处理发酵液时的温度，就可以采用加热的方法除去可溶性杂蛋白。在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到80可以使蛋白质变性凝固，降低发酵液的粘度，在除去杂蛋白的同时，过滤速度也得到了提高。再如黄原胶发酵液的预处理，在pH6.56.9条件下，80130加热1020min，就可钝化内含的某些酶类及杀死菌体细胞，有助于发酵液的过滤澄清。该

13、方法操作简单，成本低，但是热处理法容易导致目标产品的变性，因此，目标产品为热敏性物质时，应该谨慎使用。2.1.2.2.3溶剂沉淀法有机溶剂的加入，使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，即破坏蛋白质胶体的水膜，同时也可以降低溶液的介电常数。这使得蛋白质之间的静电引力增大，产生凝聚和沉淀。由于有机溶剂沉淀也是利用同种分子之间的相互作用，因此无机盐对蛋白质的溶解度影响很大，在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀，所需的有机溶剂量较少。并且随着蛋白质相对分子质量的增大，有机溶剂沉淀越容易进行，有机溶剂的加入量也越少。有机溶剂的密度较低，使得产生的沉淀物易于分离。但该法容易引起目标蛋白质变性

14、，沉淀操作必须在低温下进行。此外，有机溶剂和低温操作的成本都较高，所以在生产过程中，该方法一般只适用于液体处理量较少的情况。常用于沉淀的有机溶剂有丙酮和乙醇。2.1.2.2.4吸附法杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。例如，利用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾Fe (CN)62胶状沉淀来吸附蛋白质，这种方法在四环素类抗生素的生产过程中已经取得了很好的效果。吸附法的另一个典型实例是在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入可以生成庞大凝胶的氯化钙和磷酸氢二钠，凝胶将蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中一同除去，还可加快过滤速率。2.1.2.2.5 其他方法聚电解质、某些多价金属离子和非离子

15、型聚合物（如聚乙二醇）也可作为蛋白质的沉淀剂。聚电解质在蛋白质之间架桥，从而生成沉淀。蛋白质可与聚电解质如羟甲基纤维素、卡拉胶、海藻酸盐、果胶酸盐和酸性多糖等形成沉淀。由于蛋白质是两性物质，因此在蛋白质的酸性溶液中加入聚电解质，还兼有盐析和降低水化程度的作用。在碱性溶液中，阳离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Pb2+等可与蛋白质分子上的某些残基相互作用形成沉淀。Ca2+、Mg2+可与羧基结合，Mn2+、Zn2+可与羧基、含氮化合物及杂环化合物结合。金属离子沉淀法的可以沉淀浓度很低的蛋白质，沉淀产物中的重金属离子可通过离子交换树脂或螯合剂除去。在D核糖发酵

16、液中添加10%15%的饱和醋酸铅，残蛋白可基本除尽，并且，生成的醋酸铅有一定的絮凝作用，对后续处理有积极作用。此外，在酸性溶液中，三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等物质中的阴离子也可以使蛋白质沉淀出来。2.1.3有色物质的去除在发酵的过程中，培养基本身可能带入色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深；此外，微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色物质。但是，从提高产物的质量的观点来看，又必须除去发酵液中有色物质3。色素的化学结构比较复杂，性质多样，给脱色工作带来了相当大的麻烦。常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等。吸附法可以不用或少用有机溶剂

17、，操作简便，设备简单，生产过程中的pH值变化范围小。陈碧娥等人采用K15颗粒活性炭作脱色剂对L乳酸发酵液进行脱色，脱色率达到97%，而乳酸钙的损耗仅为1%左右。常用于吸附的树脂又称为“脱色树脂”，它表面积大，具有多孔性，吸附能力强等特点。在发酵工业中多用于脱色、吸附大分子的产物和除去蛋白质。近年来出现的大网格树脂孔隙大，树脂内表面积大，也可应用于脱色工艺。例如食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂。此外，脱色工艺还可以利用某些离子交换树脂进行。例如，采用强碱性阴离子交换树脂，使果胶酶溶液脱色，酶活损失率不超过15%20%。阴离子交换树脂对糖浆中的有色物质具有很强的吸附能力，可以用在谷氨酸发酵液的

18、脱色中，树脂的最佳操作形式为磷酸盐式。用DEAE纤维素从含酶溶剂中吸附有色物质，通常可同时除去非活性蛋白质，使主产物纯化25倍。另外，现在的预处理工艺也采用工业酶制剂完成，如净化发酵产物、除去干扰性浑浊物。用淀粉酶将发酵液中残留的不溶性多糖转为单糖，可以提高过滤速度；用带电胶体如鱼胶添加到浑浊的饮料中以除去悬浮体等等。2.1.液处理性能的改善4.1降低发酵液的粘度根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此降低液体粘度可以有效的提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加热法和加水稀释法两种。升高发酵液的温度可以有效的降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在合适的温度和受热时间下，蛋白

19、质会凝聚，形成大颗粒的凝聚物，发酵液的过滤特性得到了进一步的改善。但是，生物产品往往对温度敏感，因此，加热时必须严格的控制加热温度和加热时间。首先，加热温度必须低于目的产物的变性温度：其次，温度过高或时间过长，细胞溶解，会使胞外物质外溢，反而增加了发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。例如，在40时，12Be麦芽汁的粘度为1.210-3Pas，当温度升至75时，粘度可下降一半，过滤速率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH值3.0的条件下，升温至70后维持半小时，可使液体粘度下降1/6，过滤速率增大10100倍。加水稀释法也是降低发酵液粘度的方法。但是，稀释后悬浮液的体积增大，加大了后续过程的处

20、理任务。针对过滤操作而言，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比，才能认为有效，即若加水一倍，稀释后液体粘度应下降一半以上，过滤速率才能得到有效提高。4.2 调节pH值调节pH值是发酵液预处理的常用方法之一。因为pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可以改善其过滤特性。首先，对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将pH值调至等电点，即可沉淀除去。其次，在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于膜上，调节发酵液的pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减少膜的堵塞和污染。此外，在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤操作的进行。除

21、降低粘度和调节pH值外，还可采用絮凝操作改善发酵液的处理性能。由于絮凝是一种重要而且常用的预处理方法，所以将其单独列出详细叙述如下。5 絮凝技术细胞的富集和去除是产物分离纯化的第一步。对于胞外产物,需要分离除去细胞。对于胞内产物，需要富集细胞，然后将细胞碎片从破碎液中除去。这些操作都含有共同的一步，即细胞（细胞碎片）的富集或分离。目前细胞分离的方法主要有离心和过滤。从悬浮液中分离固形物的速度，取决于该液体的物理性质。不同菌种和培养条件的发酵液，流变特性不同。细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤，由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质的存在会造成滤液混浊，滤速极慢。若直接用

22、离心法实现固液分离，则能耗很大。应用微滤的方法除去细胞碎片，易产生膜堵塞。采用细胞絮凝技术，可以增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度，再结合其他的预处理方法（如前文中提到的稀释、加热等方法）以降低发酵液粘度，就能采用普通过滤方法，简单有效的实现固液分离。5.1絮凝和凝聚的区别絮凝和凝聚的概念，过去常常混淆，现在已逐步被区分开来。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程（见图12）。而凝聚是指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象2。也有的说法称凝聚是指使极小的微粒互相粘着在一起的情况。这种情况是

23、由于微粒所带电荷被加入的带有相反电荷的高价离子所中和而引起的。以前，人们大多采用无机盐来实现凝聚，现在，有机高聚电解质得到了越来越广泛的青睐4。近年来，絮凝作为一种能耗低、易操作、工作量小的分离方法，受到普遍的关注4。图12 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图(a)聚合物分子在液相中分散、均匀分布在离子之间；(b)聚合物分子链在粒子表面的吸附；(c)被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作用，是架桥作用的平衡构象；(d)脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用；(e)絮团的打碎5.2细胞絮凝的种类细胞絮凝方法按有无添加絮凝剂划分有两类：自身絮凝，即采用物理手段，如保温或调节pH，是细

24、胞自身絮凝；絮凝剂絮凝，即添加絮凝剂使细胞絮凝沉降5。细胞自身絮凝，从本质上讲，仍是由细胞分泌在表面的絮凝物质造成的，即由微生物絮凝剂产生絮凝。所谓微生物絮凝剂，是指一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质，一般为糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等高分子物质。近年来，微生物絮凝剂由于具有絮凝活性高、安全无害和不污染环境等优点，得到了较快的发展6。此外，人们也可利用生物技术对细胞本身进行改造，使其分泌出絮凝物质，产生细胞自身絮凝，达到回收或循环细胞的目的。例如，酵母细胞即具有分泌微生物絮凝剂实现自身絮凝的特性。据分析，酵母细胞产生絮凝现象的原因主要有三种：（1）链形成凝聚：在酵母细胞繁殖过程中，芽细

25、胞未能从母细胞体脱落，不断的进行细胞繁殖之后形成细胞链；（2）交配凝聚：由不同交配型细胞交换交配信息之后，通过细胞表面特殊的蛋白与蛋白连接引起细胞凝聚；（3）无性絮凝：由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露聚糖结合所引起的细胞凝聚，即真正的絮凝6。根据生理生化试验及不同的糖抑制作用类型，可将酵母絮凝分为FLO1型和New FLO1型。Callejia将酿酒酵母凝聚现象归纳成图13所示7：啤酒酵母的凝聚作用链形成凝聚 无性絮凝 交配凝聚FLO1表型 New FLO1表型（甘露糖专一抑制） （葡萄糖及甘露糖专一抑制）图13 啤酒酵母絮凝的分类对于酵母自絮凝现象，早期曾有“絮凝共生假说”、“蛋白质沉淀假

26、说”、“絮凝胶体假说”等理论对其机制进行解释，目前这几种假说已被“类外源絮凝聚素假说”和“病毒假说”等取代了。5.3 絮凝剂的分类5.3.1常见的絮凝剂絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂及表面活性剂。主要几种絮凝剂如表11811所示。如果根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂又可分为非离子型、阴离子型（含羧基）和阳离子型（含胺基）三类。根据第一种分类方法，目前最常见的高聚物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物、壳聚糖絮凝剂、聚苯乙烯类衍生物等。高聚物絮凝剂具有长链状的结构，利用长链上的活性基团，通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用

27、量少（一般以ppm计算），絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以使用范围广，目前主要用于提纯杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。它们的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺。因此，应谨慎使用。近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。元平言等12人就利用工业纯度的阳离子型聚丙烯酰胺（相对分子质量大于200万）对螺旋霉素（SPM）发酵液进行预处理的效果进行了研究，证明在低浓度范围内就可以使滤液效价明显升高。在青霉素发酵液的絮凝过程中，聚丙烯酰胺的浓度达到0.02%0.03%时，菌丝体和其他蛋白质就可以充分絮凝和架桥，使粒子紧密粘合而沉淀，大大

28、提高了过滤速率。由于高聚物絮凝剂絮凝效率高，速度快，所需絮凝剂的浓度低，因而絮凝工艺成本低廉5，并使高聚物絮凝剂成为今后絮凝剂研究开发的方向。表11 絮凝剂的种类及应用絮凝剂种类絮凝剂絮凝细胞高聚物核酸DNA细菌蛋白质 -细菌纤维素 -酵母聚电解质聚丙烯酰胺细菌聚乙烯亚胺细菌多糖葡聚糖细菌壳聚糖酵母有机物溶剂乙醇酵母丙酮酵母其他有机物腐殖酸酵母鞣酸 单宁酵母无机物金属离子镁盐细菌、酵母钙盐细菌、酵母铝盐酵母、藻类无机盐硼酸盐酵母壳聚糖是一种天然的高分子物质，由于分子中含有大量的氨基，所以它对蛋白质和其他胶体物质具有很强的絮凝作用，可以作为阳离子絮凝剂使用。壳聚糖的种类对絮凝效果有一定的影响，这

29、是由于絮凝剂分子量提高，链增长，可使架桥效果更加明显。但当分子量增大到一定程度后，壳聚糖的水溶性就会下降。除此之外，海藻酸钠、明胶、骨胶、等天然物质也有絮凝作用。这些天然高分子物质无毒无害，环境友好，所以是絮凝剂研发中极具潜力的一个方向。有机溶剂如乙醇、丙酮和甲醛等对发酵液的预处理也有一定的影响。表面活性剂（如BAPE）可以提高预处理效果。无机絮凝剂主要有Al2(SO4)3、NaCl、NA3PO4、CaCl2和明胶等。它们可以与有机絮凝剂共同作用达到初步纯化的目的。5.3.2 新型絮凝剂（1）主絮凝剂助絮凝剂：该种絮凝剂的制作方法与普通絮凝剂不同，比以往的有机和无机絮凝剂复杂，但是用量少，效果

30、更明显。如在维生素生产过程中，去除蛋白质等易乳化的杂质所用的新型絮凝剂13主要由主絮凝剂A和助絮凝剂B组成，絮凝作用由两者协同完成，主絮凝剂A吸附蛋白质，助絮凝剂B将吸附蛋白质后的主絮凝剂进一步交联，加快其沉降速度。（2）新型絮凝剂F-71714：它是一种网状多聚电解质的分散体（由强碱性阴离子交换树脂经物理磨碎得到），在生产抗生素的预处理过程中效果很好。（3）SPAN絮凝剂15：它是一系列不同接枝率的淀粉与聚丙烯酰胺的接枝共聚物。淀粉类絮凝剂价格低，絮凝效率高，已经在国外实现了工业化生产，我国发展才刚刚起步。5.4 絮凝机理和动力学5.4.1 絮凝机理絮凝机理比较复杂，到目前为止，主要有三种理

31、论：（1）胶体理论Leif Eriksson16把细菌直接当作胶体溶液中的胶粒来解释絮凝过程。絮凝是由于细胞表面的极性基团引起的表面吸附，而使表面自由能降低的过程。（2）高聚物架桥理论W.C.Megreor17发现细胞在表面分泌出许多高聚物如蛋白质、多糖等，这些高聚物在细胞膜表面形成胞外纤丝。细胞的絮凝是由于这些胞外纤丝之间架桥交联形成的。这个理论可以解释絮凝取决于细胞生长的胞龄以及表面分泌物的种类和数量。（3）双电层理论大多数细胞表面都有一定的电荷，絮凝过程是加入电解质后，相同电荷的排斥以及细胞表面水合程度不同而产生聚并的过程。Kakii通过实验证实细胞表面的离子键和氢键参与了细胞的絮凝过程

32、18。5.4.2 絮凝动力学细胞絮凝动力学比较复杂，一般认为，絮凝有两种：同向絮凝和异向絮凝。同向絮凝是因流体流动产生的絮凝，而异向絮凝是由流体分子布朗运动产生的聚并19。当絮凝颗粒的直径小于1m时，异向絮凝占主导地位；当絮凝颗粒的直径大于1m时，同向絮凝占主导地位。对于同向絮凝，絮凝颗粒的长大过程可用下式表示：（11）在（11）式中，Ni和Nj分别为i种和j种颗粒的分子数，对于同种细胞絮凝，N=Ni=Nj。Rij为颗粒i和j聚并后的颗粒直径，du/dz为速度梯度。如果细胞颗粒的总体积V=1/6Rij3N为定值，即细胞没有生长和破裂时，积分（11）式可得：（12）由上面的公式可得到如下几点结论

33、：（1）絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅拌应剧烈一些，絮凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅拌速率应降低。（2）增加颗粒（细胞）的浓度，有利于聚并絮凝。（3）加大搅拌，增加速度梯度，有利于颗粒聚并，但搅拌速率过大时，剪切力会导致絮凝体破裂。5.5 絮凝的优化选择使用何种絮凝剂要综合考虑成本、可行性、毒性等多方面因素。此外，絮凝效果与絮凝剂的加入量、分子量和类型，溶液的pH、搅拌速度和时间等因素有关。絮凝剂的最适加入量要通过实验决定。虽然较多的絮凝剂有助于增加桥架的数量，但是添加量过多反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径变小，絮凝效果下降。溶液pH值的变化会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度，从

34、而影响吸附作用的强弱。在絮凝过程中，加入一定的助凝剂可以增加絮凝效果2，当加入助凝剂后，悬浮液就会变得不稳定，这时再加入絮凝剂就会增加凝聚速率和絮凝团的大小和强度。甘油发酵液的预处理是利用高分子絮凝剂絮凝去除甘油发酵液中的菌体20。通过研究pH值、絮凝剂用量、絮凝温度对絮凝效果的影响找到了适宜的絮凝条件：pH =510，温度3040，(絮凝剂)=0.60.8 g/L。此时菌体絮凝率(FR)可达90%以上。经絮凝处理后，滤速为未加絮凝剂的2.54.5倍；滤液中菌体去除率可达100%；固形物的回收量为未加絮凝剂的2.1倍；滤饼的含湿量由71%增加到78%。聚合物溶液浓度最大即为高粘度状态时，浓度通

35、常为0.51%（W/V）。在减少絮凝剂的增加量之前，溶液需先进行稀释。但是，应注意制造业中的推荐标准（通常最终浓度控制为0.01%）。为了除去一些杂质，在加水和强力搅拌之前应加入少量乙醇或甲醇。最终絮凝剂浓度的数值单位应表示为mg/g细胞或mg/m2细胞表面，这样就可以将试验的结果与一致剂量作比较。絮凝的优化流程如下：（1）准备好所需的絮凝剂及化学试剂；（2）分别往烧杯中倒入5001000ml的悬浮液试样；（3）搅拌（桨叶速率可为200r.p.m）；（4）通过加酸或加碱来调节每个试样的pH值（例如，如果有6个试样，则分别使其pH为4、5、6、7、8和9）；（5）同时向各烧杯中加入助凝剂，并开始

36、计时；（6）继续保持高搅拌速率5min；（7）加入絮凝溶液，于1min内混合均匀；（8）降低搅拌速率（例如降至50r.p.m）保持15min；（9）分析絮凝结果（可通过静置或过滤等方法）21。周荣清22等通过测定滤饼常数，对絮凝法预处理透明质酸发酵液进行了研究。在确定絮凝剂的种类时，通过比较聚丙烯酰胺和壳聚糖两种絮凝剂的絮凝效果，发现对于透明质酸发酵液，阴离子型聚丙烯酰胺(AN926)效果较好。并且确定了最佳的絮凝条件。在pH值6.5、搅拌速度60/min，絮凝温度45的条件下, 絮凝剂的添加量为10010-3/mgml-1时絮凝效果最好。除了絮凝剂的种类和浓度，剪切力及处理时间（絮凝与进一步

37、分离之间的间隔时间）也是很重要的优化参数。延长处理时间会导致微粒体积变大，数量减小；而提高剪切力则会产生相反的结果。另一些胶团特性，例如强度（即对剪切力和压力的耐受程度）和沉淀物及滤饼的流变学特性也会受到处理条件的影响。5.6絮凝设备絮凝设备5包括絮凝器及絮凝颗粒分离设备，絮凝器主要有以下几种19：5.6.1浆叶式絮凝器浆叶式絮凝器的转动轴可绕水平或立轴转动。如图13：图13 浆叶式絮凝器A:水平轴式；B:立轴式1：电机；2：浆叶（多级）；3：絮凝池；4：减速器浆叶可以是螺旋桨叶或涡轮桨叶。浆叶式絮凝器设备结构简单，可以采用多级浆叶，转速递减絮凝。在絮凝初期，高转速快速混合；在絮凝后期，低速搅

38、拌，使絮凝体长大。5.6.2 折流式絮凝器在絮凝器中加入折流板，使其结构为迷宫式或蜂窝式，有利于絮凝颗粒的形成。近年来开发的lamella絮凝器也是一种折流式絮凝器23，已成功的应用于酒精的连续发酵。发酵和絮凝设备工艺如图14所示： 图14 lamella絮凝器1：罐；2：絮凝器；3：折流板；4：泵5.6.3 其他絮凝器其他絮凝器包括管式絮凝器和颗粒絮凝器。管式絮凝器主要用于增加沉降面积、加速絮凝。而颗粒絮凝器又分为固定床和流化床两种，此处不再一一介绍。5.7絮凝技术的应用絮凝技术作为一种有效的生化分离方法，被广泛的应用于细胞体、细胞碎片及可溶性蛋白质的处理中，成为连续发酵和分离生化产品过程中

39、常采用的预处理方法。5.7.1 在除去细胞体、细胞碎片及蛋白质中的应用在酶分离过程中，如果目的产物是胞外酶，则絮凝剂不会对其产生干扰。由于絮凝剂与细胞结合在一起，它有可能在细胞被破碎后干扰胞内酶。除了酿酒行业，其他领域几乎没有关于絮凝剂的基础研究。Nakamura列出了一些对絮凝剂的要求，包括低成本、低用量、对pH改变不敏感等。Gasher和Wang24也研究了许多天然的以及合成的聚合絮凝剂，包括带电的与不带电的，它们对于酵母的影响见表1224。表12絮凝剂对酵母菌的影响絮凝添加剂细胞沉淀物百分比010506.5）时絮凝沉淀的特性，达到分离纯化WGA的目的。J.Bonnerjea29利用硼酸盐

40、和酵母表面的多羟基胺之间的专一性交联作用，除去含有多羟基的酵母细胞碎片，分离回收乙醇脱氢胺，酶的收率在90%以上。硼砂作为絮凝剂的效果比高分子絮凝剂好，这是因为硼砂仅对碳水化合物产生交联，具有选择性；交联反应瞬时完成，有利于在线混合与工业连续生产。5.8.2传统絮凝技术的改进絮凝起初只是作为离心分离和过滤的预处理手段，但是随着絮凝技术的发展，絮凝剂间的混用，絮凝剂与无机盐或助凝剂的混用，絮凝与其它分离方法的结合以及微生物絮凝引起了人们日益浓厚的兴趣。Persson Ingalill30研究了以絮凝细胞碎片来提高离心分离效率的方法，认为有可能在大规模分离中利用连续离心分离器获得良好的分离效果。但

41、是，絮凝沉淀物的体积较大，必须回收其中的发酵液，才能提高产品的收率。由此看来，必须将传统絮凝技术进行改进，以提高絮凝沉淀的效果。传统絮凝技术的改进方法之一是将絮凝剂与无机盐助凝剂混用。该方法已应用于生产。吴振强等31采用天然无毒絮凝剂GFI和无机盐Fe2(SO4)3H2O协同作用除去肌苷发酵液中的菌体，可以省去原工艺中的阳离子吸附柱，直接采用炭柱吸附，此法不仅可使提取周期大大缩短，而且可以降低能耗，提高提取收率。李红光等32使用铝盐或钙盐作为絮凝剂，使味精产量提高10%，质量明显提高，能耗明显降低。该方法与高速分离及分离菌体法相比，设备费用仅为高速离心机的1/10。絮凝剂间的混用也是一种新的改

42、进方法。在这种方法中，选择适宜的高分子絮凝剂匹配类型以达到复合絮凝的效果时，必须根据絮凝对象和使用设备型号，经模拟试验方能确定。实验证明，在某些情况下，絮凝剂单独使用不如按比例混合使用的效果好。刘红等33利用两种无毒絮凝剂GAF和壳聚糖对味精发酵液的絮凝作用进行研究，两种絮凝剂联合使用的效果远远好于单独使用时的效果。味精发酵液OD值降至0.045，除菌率为98.5%；应用联和絮凝剂，透光率达100%，除菌率为98.8%。Savage，Christopher M.34利用阴离子型和阳离子型絮凝剂混合作用于E.coli溶液，尤其是在将利用菌体表达的蛋白、肽或氨基酸等可溶性物质与细胞或细胞碎片分离的操作中取得了良好的效果。Koster，Frans等35利用絮凝剂与两性去垢剂和适当的盐共同作用于疏水产物的发酵液中，一步操作便可得到高纯度的产品，而且此法已在大规模分离纯化中应用。絮凝是发酵液预处理中较有效、较重要的一种方法。当发酵液絮凝结束后就可以进行过滤和离心了。当然，如