铜离子固定金属亲和色谱在生物大分子中的应用.doc

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1、铜离子固定金属亲和色谱在生物大分子中的应用王燕李蓉 3陈国亮王小刚( 西北大学化工学院 西安 710069)摘 要铜离子固定金属亲和色谱作为一种有效的分析方法 ,已普遍应用于生物大分子的分离与纯化 。本文从理论和应用两个方面就新型基质 、螯合配体 、色谱动力学 、联用技术以及蛋白质分离纯化 、复性等方面 进行了评述 。关键词铜离子固定金属亲和色谱 生物大分子 螯合配体 色谱动力学Appl ications of Cu ( II) 2Immobil ized Metal Aff inity Chromatogra phyin BiomacromoleculeWang Yan , Li Rong

2、3 , Chen Guoliang , Wang Xiaogang( College of Chemical Engineering , Northwest University , Xian 710069)Abstract Cu ( II) 2immobilized metal affinity chromatography ( Cu ( II) 2IMAC) , as a highly reliable analytical procedure , has been widely used in separation and purification of biomacromolecule

3、 . The application of Cu( II) 2IMAC in biomacromolecule including the novel types of matrices and chelating ligands , chromatographic dynamics , combinationtechniques , protein purification and refolding are introduced.Key wordsCu ( II ) 2immobilized metal affinity chromatography , Biomacromolecule

4、, Chelating ligand ,Chromatographic dynamics1975 年 ,Porath 等基于生物大分子与固定在基质上的 Cu2 + 间的亲和作用进行分离 ,提出了铜离子固定金属亲和色谱 ( Cu ( ) 2IMAC) 的概念 ,以研究蛋白质 、核酸 、酶等生物大分子与重金属 Cu2 + 间的作用 ,后来发展成一种新的分离方法 。亲和作用的实质是 ,生物大分子中的给电子基团与能提供一个或多个 配位点的电子受体 Cu2 + 间的反应 。当生物大分子 ,如蛋白质 ,与 Cu2 + 螯合配体结合时 ,从 Cu2 + 螯合配 体中取代了弱结合的配位体 (如 H2 O) ,

5、被吸附的蛋白质通过质子化作用 (降低溶液的 p H) 或加入竞争洗脱剂 (如咪唑 、甘氨酸 、组氨酸等) 而可以被洗脱 。不同的蛋白质与 Cu2 + 有着不同的亲和力 ,多数情况下 正是利用这种差异对蛋白质进行有效分离和纯化 。对于 IMAC 技术在生物大分子研究领域的推广及应用 ,已有多篇综述论文1 5 。Cu2 + 与表面含组氨 酸的蛋白质强烈结合 ,蛋白质在 Cu ( ) 柱上的色谱行为较其它金属螯合柱更具有金属螯合特征 。本文在总结前人工作的基础上 ,结合笔者近几年来的研究体会6 ,7 ,着重对 Cu ( ) 2IMAC 固定相研究及其在 生物大分子研究领域中的应用进行评述 。Cu2

6、+ 螯合吸附剂的组成Cu2 + 螯合吸附剂是由被固定的金属 Cu2 + 、基质和螯合配体三部分组成 ( 图式 1) 。螯合配体通过共 价键与基质结合形成固定相 ,当引入 Cu2 + 时 ,螯合配体与 Cu2 + 形成可与蛋白质发生作用的 Cu2 + 螯合吸 附剂 。表 1 列出了常用于 Cu ( ) 2IMAC 的商品固定相填料 。1陕西省自然科学基金项目 (2007B22) 、西北大学校基金项目 (U5NW4) 资助2008201231 收稿 ,2008203220 接受图式 1 Cu( ) 2亚氨基二乙酸( IDA) 2蛋白质配合物Scheme 1 Coordination compoun

7、d of Cu( ) 2 Iminodiacetic acid ( IDA) 2Protein表 1 Cu( ) 2IMAC 的商用固定相填料Ta b. 1 Commercially ava ila ble resins used in Cu( ) 2IMAC制造商商品名基 质配 体PE2BiosystemsApplied Biosystems交联聚苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯二乙烯苯亚氨基二乙酸亚氨基二乙酸POROS MCPoros 20MCIMAC Sepharose High Performance Media Chelating Sepharose Fast Flow HiTrap Chel

8、ating HP Columns STREAML INE ChelatingTSK Chelate25PWCIM discProfinity IMAC Uncharged ResinNTA agarose NTA Superflow Cu2PDC2Sepharose Cu2PDC26FF Immobilized IDAToypearl AF2Chelate2650MIontosorb OXIN6 %高交联琼脂糖亚氨基二乙酸GE Healthcare6 %大孔高交联含晶型石英核琼脂糖聚甲基丙烯酸酯类 甲基丙烯酸缩水甘油酯2二甲基丙烯酸乙二酯共聚物 UNO 球型基质交联琼脂糖6 %高交联琼脂糖To

9、soHaasBiaSeparationsBio2Rad亚氨基二乙酸亚氨基二乙酸 亚氨基二乙酸Qiagen次氮基三乙酸交联琼脂糖羧基戊二胺三乙酸AffilandPierce BiotechnologyTosoh Bioscience琼脂糖甲基丙烯酸类聚合物亚氨基二乙酸亚氨基二乙酸82羟基喹啉Iontosorb纤维素微球 Iontosorb IDA 亚氨基二乙酸111固定的金属铜离子( )金属离子与不同蛋白质作用时 ,由于金属离子所带电荷 、离子半径和电子层结构的不同 ,对蛋白质呈现出不同的亲和力 。当电荷数相同时 ,金属离子半径越小 、晶体场稳定化能 ( CFSE) 越小 ,配位作用越 强 ,与

10、蛋白质形成的配合物越稳定 。与带有相同电荷的其它过渡金属离子如 Ni2 + 、Zn2 + 和 Co2 + 相比 ,Cu2 + 半径最小 ,其配位化合物稳定化能最低3 ,因此金属螯合 Cu ( ) 柱对蛋白质具有最强的结合力 。Cu 是一个具有 d 层空价电子轨道的过渡金属 ,可与配位体形成能同蛋白质结合的 Cu2 + 螯合配体 。根据Pearson 软硬酸碱理论 ,Cu2 + 是交界酸 ,它可优先与同属交界碱的芳香族氮原子和软碱硫原子 ,如组氨酸 中的咪唑基 、色氨酸中的吲哚基和半胱氨酸中的巯基配位 。通常蛋白质表面组氨酸数目越多 ,解离常数越大 ,配位原子中孤对电子取向与 Cu2 + 中空价

11、电子轨道的伸展方向越一致 ,蛋白质与 Cu2 + 螯合配体就 越容易成键 。当蛋白表面的组氨酸 ( His) 分布呈2His 、2His ( Xn ) His 、2His ( Xn ) His ( n ( 2 , 3) 、2螺旋) 、2HisHis2时3 ,8 ,半胱氨酸 ( Cys) 的分布为 Cys ( XX) Cys 时 ,均可被金属螯合 Cu ( ) 柱吸附5 。112 基 质基质的作用是支撑螯合配体 ,它对 Cu2 + 和蛋白质之间形成多种配合物的稳定性有很大的影响 。用 于 Cu2 + 螯合色谱中的基质主要分为无机和有机基质两类 。常见的无机基质为硅胶 ,有机基质有琼脂糖(Agar

12、ose) 、交联琼脂糖 ( Sepharose) 、交联葡聚糖 ( Sephadex) 、大孔纤维素以及有机聚合物 TSK2gel G500PW 等 。不同类型的基质直接影响着 Cu ( ) 2IMAC 对生物大分子的选择性 。Ren 等9 利用金属螯合 Cu ( ) 柱 ,对以 IDA 为配体的 HiTrap Chelating HP 、TSK Chelate25PW 、Poros 20MC 和 CIM discs 等 4 种不同基质对组氨酸肽的选择性的研究表明 ,不同基质的物理 、化学性质的差异直接影响着它们对组氨酸肽的亲和率 。随着 Cu ( ) 2IMAC 技术在生物大分子研究领域的不

13、断发展 ,近年来 ,又出现了一些新的基质 。McCarthy 等10 利用原子转移共聚方法在无孔聚合珠表面形成含金属的微粒 ,开发出了一种用于分离朊病毒肽和蛋白质的 IMAC 固定相 ,利用与蛋白2Cu 结合区类似的合成肽考察了柱子的分辨力 。J ain 等11利用表氯醇交联聚合物制备出以藻蛋白酸盐为基质的固定金属螯合 Cu ( ) 柱 ,直接用来纯化山羊免疫 球蛋白 G( Ig G) , 获得了较好的蛋白回收率 和 纯 化 倍 数 。Bayramoglu 等12 用 甲 基 丙 烯 酸 22羟 乙 基 酯( HEMA) 和脱乙酰壳聚糖 (p HEMAChitosan) 在引发剂 2 ,22偶

14、氮二异丁腈存在下 ,通过紫外辐照聚合合成了互穿网络膜 ( IPNs) ;把 PB MX25BR 作为螯合染料配体共价键合到 IPNs 膜上 ,固定上 Cu2 + 作为控制 系统 ,研究了标准蛋白 Lys 在 IMAC 吸附剂上的结合特征 ,以及在水溶液中 Cu2 + 对 Lys 的选择性 。邱雁临等13用以壳聚糖为载体 、Cu2 + 为配基的螯合亲和吸附剂分离纯化谷胱甘肽 。Xi 等14 用在无孔硅胶上浸涂大孔脱乙酰壳聚糖作为 IMAC 吸附剂载体所制备出的 Cu2CTS2SiO2 来作为 Cu ( ) 2IMAC 的基质 。刘琳琳等15 以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体 ,Cu ( ) 2ID

15、A 为金属螯合配体 ,定向固定了木瓜蛋白酶 。骆红琴等16 采用溶胶2凝胶法 ,在正庚烷乳液中制成无孔脲醛树脂2ZrO 复合微球基体 ,利用迈克尔加成22 +反应通过亲核取代与螯合剂 IDA 键合 ,制成 IDA2UF2ZrO2 固定相 ,在与 Cu 螯合后 ,形成金属螯合亲和色谱固定相 ( Cu2IDA2UF2ZrO2 ) ,考察和评价了牛血清蛋白 (BSA) 在此固定相上的色谱性能 。113 螯合配体螯合配体主要是用来固定 Cu2 + ,为保证被固定的 Cu2 + 在色谱过程中不流失以及选择性地结合蛋白 质 ,使用的螯合配体应当满足 : (1) 具有与间隔臂偶合的官能团 ; ( 2) 具有

16、能与被固定的 Cu2 + 强烈结合 的多个配位原子 ,并且能形成牢固的环状螯合物 ; (3) 配位原子的数目不应超过 Cu2 + 的配位数 ,以保证 Cu2 + 被固定后还剩余足够多的且能满足蛋白质分子配位的空价电子轨道 ; (4) 选择的螯合配体不应损害蛋白质的功能和酶的活性 。符合上述条件的 Cu2 + 螯合配体通常分为三大类 : 多齿配体 、染料配体以及 其它的给电子分子 。根据配位原子数的不同 ,多齿配体又可分为单齿 、二齿 、三齿 、四齿和五齿配体 ,而 用于金属螯合 Cu ( ) 柱的配体主要为三齿 ( 如亚氨基二乙酸 , IDA) 、四齿 ( 次氮基三乙酸 ,NTA ; 三氨基

17、乙基胺 ,TREN) 、五齿配体 ( N , N , N , 2三羧甲基乙二胺 ,TED ;羧基戊二胺三乙酸 ,PDC) 。根据分子结构以 及多齿螯合机理 (图式 2) ,配位原子数目越多 ,与被固定的 Cu2 + 形成的螯合配体越稳定 ,Cu2 + 越不易泄漏 。但当螯合配体的配位原子数等于或超过 Cu2 + 的配位数时 ,中心 Cu2 + 的配位点被完全占据 ,无法再图式 2 Cu( ) 2多齿配体螯合物Scheme 2 Multidentate chelators in complexes with Cu( )与蛋白质表面的给电子原子结合 。因此 ,选择的螯合配体既要保证能与 Cu2 +

18、 牢固结合 ,还要保证 Cu2 +满足蛋白质分子配位的需要 。实践证明 ,具有 3 个和 4 个配位原子的三齿和四齿螯合配体较为适用5 。三嗪类染料是近年来新开发的螯合配体 。这一类染料如 Cibacron 蓝 ( CB) 、Cibacron 红 ( CR) 、Procion 褐( PB) 等17 112 ,18,均可与 Cu2 + 配位 。与多齿配体相比 ,染料配体对 Cu2 + 螯合配位的稳定性较差 。此外 ,在一些条件下 ,染料配体对生物大分子的吸附除了与 Cu2 + 螯合配位作用有关 ,还与其自身的染料亲和作用有关16 。其它的给电子分子也可作为新的螯合配体 ,如在 Cu ( ) 2I

19、MAC 梯度洗脱过程中常用作竞争 洗脱剂的咪唑19 。然而 ,这类分子与 Cu2 + 螯合配位的稳定性以及配位特性还待进一步评估 。金属螯合 Cu( ) 柱应用于生物大分子领域的研究进展近期的研究仍然从理论和应用研究两个方面展开 。理论方面主要集中在金属螯合 Cu ( ) 柱的动 力学研究 ;应用研究主要围绕着对不同研究对象 、研究方法和技术的探讨 。211 理论研究近年来 ,一些学者运用动力学方法系统地研究了金属螯合 Cu ( ) 柱对蛋白质 、Cu2 + 的动态吸附特 性 。Gutirrez 等20 用此方法研究了 Cu ( ) 2IMAC 中的质量传递过程 。在不同 p H 条件下 ,测

20、定了 Cu , Zn 超氧化物歧化酶 ( Cu , Zn2SOD) 在 Cu ( ) 2IDA2agarose 柱上的吸附平衡常数和吸附速度常数 。结果表 明 ,该蛋白在 Cu ( ) 2IDA2agarose 柱上的吸附主要受内外质量传递过程控制 。p H 对动力学参数的影响表现为 ,随着 p H 减小 ,吸附平衡常数 、分子和粒内有效扩散系数增加 ; 而内外和总的质量传递以及轴向 扩散减小 。Tsai 等21 报道了含有 8 个组氨酸标记的 4 个同质低聚重组蛋白在 Cu ( ) 2IDA2硅胶固定相上的吸附平衡 。结果表明 ,这些蛋白的吸附存在着正向的协同作用 ,并且协同作用随组氨酸标记

21、数目的增加而增大 ; 蛋白质分子与 Cu2 + 吸附剂的结合强度受组氨酸标记数的支配 ; 蛋白质的特殊结构可导致2更高的吸附 容 量 和 较 低 的 亲 和 力 。改 变 条 件 , 协 同 作 用 和 结 构 的 特 殊 性 随 之 消 失 , 变 为 均 匀 吸 附 。Gutirrez 等22 利用脉冲色谱技术 ,在 Cu ( ) 2IDA2agarose 基质上 ,测定了过氧化氢酶的吸附平衡常数和动力学特征 ,考察了 p H 对吸附动力学参数的影响 。Sharma 等23 研究了不同色谱条件下两种螯合剂对 固定的 Cu ( ) 、Ni ( ) 的吸附和沥滤特性 。结果表明 ,螯合剂吸附金

22、属离子的容量强弱取决于溶液 p H的变化 ,而离子强度和注入金属离子浓度的影响较为缓和 。这些研究为制备用于分离蛋白质的稳定金属螯合剂提供了理论依据 。然而 ,目前关于金属螯合 Cu ( ) 柱动力学问题的研究大多还只是在定性水 平上 ,相关的定量数据十分有限 。尽管先后提出了 Langmuir 、Temkin 、双2Langmuir 、Langmuir ( 多层) 和 Langmuir2Freundlich 等 5 种吸附等温线模型 ,但迄今为止 ,还没有一个统一的理论或模型能够充分地描 述生物大分子在 Cu ( ) 2IMAC 体系中的吸附动力学问题5 ,6 ,24 。212 应用研究21

23、211 蛋白质的分离与纯化 由图式 1 看到 ,蛋白质在金属螯合 Cu ( ) 柱上的吸附是通过暴露在蛋白 质表面给予电子对的氨基酸残基 ( 如组氨酸中的咪唑基) ,与被固定的 Cu2 + 配位的结果 。普遍认为 ,组氨酸与 Cu2 + 的强配位对蛋白质在金属螯合 Cu ( ) 柱上的吸附起着关键性的作用 。对于表面有组氨酸残基的蛋白质 ,如含组氨酸的胰蛋白酶25 ,26 、人血浆中的凝结因子 IX27 、山羊免疫球蛋白 G11 、人免疫 球蛋白 G28 、胰高血糖素和胰岛素29 、酵母富组氨酸蛋白8 、维生素 K 依附蛋白30 、辣根过氧化物酶和 特异免疫球蛋白31 等 ,可采用 Cu (

24、) 2IMAC 一步纯化法直接提取分离 。然而 ,天然蛋白质中的组氨酸残基含量较少 ,仅占组成蛋白质氨基酸总量的约 2 % ; 并且 ,这部分氨基酸中只有一半的组氨酸残基暴 露在蛋白质表面 。目前 ,解决这一问题的最有效方法就是多组氨酸标记法 ,即通过在蛋白质的 C2或者 N2端连接上多组氨酸标记 ,来作为金属离子亲和位点 ,该法已普遍应用于重组蛋白质的纯化 。这一方法的原理是通过增加组氨酸的数目来提高蛋白质与 Cu2 + 的亲合力 ,然而过高的亲合力并不利于蛋白质的洗脱 。因此 ,理想的组氨酸标记应当长度适宜 ,允许目标蛋白在温和 、无破坏的条件下被洗脱 。现今最 受关注的是由 6 个组氨酸

25、残基构成的 His6 标记32 34 。Tsai 等21 在 Cu ( ) 2IDA2硅胶螯合柱上 ,通过对含有 8 个组氨酸标记的 4 个同质低聚重组蛋白质的吸附特性的研究 ,证明了蛋白质分子与 Cu2 + 吸附剂的结合强度受组氨酸标记数的支配 。Ho35 等利用不同密度 Cu2 + 硅胶基质螯合吸附剂 ,纯化了多组氨酸标记的 d2乙内酰脲酶 。利用这种吸附剂可一步从粗的溶胞物纯化组氨酸标记酶 ,特别适用于工业规模的制备 。此外 , 暴露在蛋白质表面的其它氨基酸残基也可与 Cu2 + 螯合剂发生配位作用 。Watanabe 等36 在 Cu ( ) 2IMAC 柱上对转染 COS7 细胞 、

26、转移基因鼠脊髓组织和转型酵母中表达的 Cu , Zn2SOD 与 Cu2 + 亲 和力大小的研究中发现 ,半胱氨酸 111 残基对 Cu , Zn2SOD 突变体的稳定性起决定作用 ,它与 Cu ( ) 的 异常结合可能是改变 Cu ,Zn2SOD 行为的重要因素 。已有报道证明 ,朊病毒蛋白能够结合 Cu2 + 。在考察 二者之间的配位情况时发现 ,朊病毒蛋白非糖基化形式较对应的糖基化形式对 Cu2 + 柱具有较高的亲和 能力 。这一发现使得通过聚糖链来控制朊病毒蛋白2 Cu2 + 结合点的可接近性成为可能37 。在对葡萄糖2甘氨酸类黑精亲和特性的研究中发现 ,带正电荷的葡萄糖2甘氨酸类黑精

27、对 Cu2 + 有很好的亲和性38 。21212 核酸的分离与纯化 Murphy 等39 报道 ,金属螯合 Cu ( ) 柱不仅可离析带有 6 个组氨酸标记的 蛋白 ,通过 Cu2 + 与芳族碱性氮原子的作用还可以吸附单链核酸 。双螺旋寡核酸质粒和基因 DNA 对金属 螯合吸附剂显示较低的亲和力 ,而 RNA 和单链的核苷酸强烈结合到 Cu ( ) 2IDA2agarose 上 。与其它过渡金属离子如 Ni ( ) ,Zn ( ) ,Co ( ) 相比 ,酵母 RNA 对 IDA 螯合 Cu2 + 的亲和力最强 。实验证明 , IDA2Cu ( ) 吸附剂对嘌呤的亲和性大大超过嘧啶 ,而双螺旋

28、型则不被结合 。Cu ( ) 2IMAC 柱已用来纯化来 自 E. Coli 碱性胞溶物的质粒 DNA ,分离含中心单碱基缺对的 202链节寡核苷酸 。潜在的进一步应用包括 SNP 划痕杂交试验和多腺苷酸的信使核糖核酸 RNA 。Potty 等40 发现 ,核酸通过暴露的碱基尤其嘌呤 也能同金属螯合 Cu ( ) 柱作用 。通过在缓冲溶液中加入适量的中性溶质 ,可大大增强核酸与 Cu2 + 螯合 吸附剂间的亲和力 。利用这种现象 ,可用 Cu ( ) 2IMAC 分离纯化核酸 。Tan 等41 利用核酸与游离和被 固定的 Cu2 + 间的相互作用 ,研究了从碱性溶胞产物中纯化含登革热发烧抗原基

29、因的质粒 DNA ,发现了用 CuCl2 沉淀结合 Cu ( ) 2IMAC 技术有效分离纯化质粒 DNA 的方法 。21213 蛋白质的定向固定 定向固定是指将生物大分子如酶 、抗体 、亲和蛋白质等先固定在高度稳定 的载体上 ,然后再利用被固定生物大分子的特性进行分离纯化的过程 。Ho 等35 利用不同密度 Cu2 + 硅 胶基质螯合吸附剂固定了多组氨酸标记的 d2乙内酰脲酶的研究证明 ,含硅胶基质 Cu2 + 螯合吸附剂的填 充床生化反应器可直接用来固定生物转化所需要的多组氨酸标记酶 。Gupta 等42 基于 IMAC 分离蛋白 质技术 ,提出了一个在 Cu ( ) 2IDA2sepha

30、rose 基质上定向固定仅含一个组氨酸的根茎菠萝蛋白酶的方 法 。用此法测到的固定酶具有较高的抗热失活能力和较宽的 p H 活性范围 。制得的基质稳定性高 、再生容易且可反复使用 。Pessela 等43 的研究表明 ,来自 Thermus Sp . T 的多聚的和半乳糖苷酶等大蛋白2被高活性的 IMAC 固定相强烈吸附 ,即使用 1molL 的咪唑也难以解析 。借此 ,可以建立一个简单纯化和可逆固定 E. Coli 克隆的大蛋白质 。21214 蛋白质的复性与纯化 刘建荣等44 将重组人铜锌超氧化物歧化酶 ( rhCu , Zn2SOD) 包涵体 ( 经纯 化后纯度达 80 %以上) 以稀释

31、法或透析法初步复性后 ,再用金属螯合亲和层析来纯化 。结果表明 ,对于 复性不完全的 rhCu ,Zn2SOD 而言 ,金属螯合 Cu ( ) 柱是一种使其纯化和复性一步完成的简便省时且有 效的方法 。该方法为以包涵体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路 。Wang 等45 用 Cu ( ) 2IDA2sepharose 亲和色谱同时复性和纯化了在 E. Coli 中表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子 ( rh G2CSF) ,实验中仅通过一步 IMAC 分离 ,减少了复性过程中 rh G2CSF 的聚集 。上述复性技术存在的问题是 ,由 E. Coli 生产的重组蛋白回收率

32、低且费用大 。如何将失活的和不溶 的变性蛋白有效地转化为可溶性的正确折叠产物 ,是当前生物工程的一个重要难题 。与标准复性技术相比 ,最近开发的基于亲和标记的“基质2助复性”技术46 ,可从内包涵体产生可溶性 、功能性的 His6 标 记蛋白 ,其复性率要明显优于前者 。然而 ,目前这一技术的应用主要集中在 Ni ( ) 2IMAC 体系47 49 ,尚 未在 Cu ( ) 2IMAC 体系中推广 。21215 联用技术的应用 固定 Cu2 + 的螯合色谱法与其它蛋白质分析技术的联用 ,主要被应用于复杂混 合物中亲 Cu2 + 蛋白 、多肽 ,尤其是亲 Cu2 + 蛋白质组的分离与纯化 。在这

33、种多维分析方法中 ,金属螯合Cu ( ) 柱起着预分离的作用 ,以提高对亲 Cu2 + 蛋白的分辨率 。在蛋白质组学的研究中 ,表面增强激光解吸离子化 ( surface enhanced laser desorptionionization , SELDI) 是近年来一个相对较新的技术 。与其它联用技术一样 ,这些方法克服了传统蛋白质组技术的不足 ,可根据蛋白质的物理 、化学和生物特性 ,将蛋白质组混合物分成“亚蛋白组”,高通量 、大规模 、自动化的分类筛选出生命体系中的表达蛋白质 ,从而准 确 、有效地揭示出细胞 、组织 、生物体间的交互作用体系和代谢路径 。上世纪 90 年代初 , Hu

34、tchens 等提出了一种适用于生物大分子质谱分析的表面增强亲和捕获 ( surface enhanced affinity capture , SEAC) 技术 。这一概念的提出对 SELDI 技术进行了改进 ,随后经过几年不断的发展 ,SELDI 逐渐成为蛋白质组学研究过程中不可缺少的重要工具 。该技术主要由蛋白质芯片 、芯片阅 读器和分析软件 3 部分组成 ,其中蛋白质芯片是 SELDI 的核心技术 。根据芯片表面修饰的不同 ,可分为 化学表面芯片和生物表面芯片 。依据固定在芯片表面的色谱介质与蛋白质表面的化学性质的不同 ,可 将 SELDI 蛋白质芯片技术分为疏水 ( H4) 、亲水

35、(NP) 、弱阳离子交换 ( WCX) 、强阴离子交换 ( SAX) 以及 IMAC 等 5 类 。其中 ,SELDI 飞行时间质谱2铜离子结合蛋白质芯片 ( SELDI TOF MS2IMAC Cu) 技术主要是通过芯片表面固定的 Cu2 + 与蛋白 、磷酸化蛋白 、His 标记蛋白以及生物标记分子间的配位作用来进行 分离纯化的 。具体过程是 ,先将金属 Cu2 + 固定在 IMAC 芯片上 ,加样至螯合配体表面 ,用缓冲溶液冲去 不保留的物质 ,再加入基质 ,利用激光脉冲将芯片表面的吸附蛋白质“洗脱”下来 ,后经飞行时间质谱检 测 (如图 1 所示) 。该技术是一种集分离 、纯化 、鉴定

36、、检测和数据分析为一体的快速 、简单 、微量 、高通量的分析方法 ,它可以直接从患者的血清 、组织 、尿液等粗生物样品中筛选出相对特异的潜在生物标记 。因此 ,在蛋白质组学 ,尤其是临床医学的研究中有着较好的应用价值 。Xiao 等51 采用此技术 ,分析了肺癌病人血清和正常人血清中的蛋白质图谱 ,根据单一标志分子检测结果 ,发现和筛选出血清中的与肺癌 相关的特异性标志蛋白 。Ren 等52 结合 SELDI TOF MS ,利用 IMAC Cu 蛋白质芯片分析了手术前后胃癌患者血清蛋白质图谱的变化情况 ,筛选出特异性蛋白标志物 ,为胃癌患者病症的快速诊断提供了依据 。郭社珂等53 利用 SE

37、LDI TOF 质谱技术 ,采用铜离子结合芯片以及相关配套软件 ,对宫颈癌组织与正常宫颈上皮组织中的差异蛋白质进行了检测分析 ,筛选出有分类意义的特异性肿瘤标记物 ,构建了决策树 分类模型 ,为宫颈癌诊断及愈后判断提供了一组可供参考的生物学指标 。吴登龙等54 采用 SELDI TOF MS 技术 ,选用 IMAC Cu 蛋白质芯片检测了膀胱移行细胞癌及对照组尿液标本 ,筛选出膀胱癌患者尿液 中相对特异的潜在标记物 ,建立了尿液树形蛋白质谱模型 ,鉴别出膀胱移行细胞癌 ,为膀胱移行细胞癌 的早期诊断提供了可靠的技术平台 ,具有较好的临床应用价值 。图 1 SELDI TOF MS IMAC3

38、Cu 蛋白芯片技术流程图50Fig. 1 SELDI TOF MS 2 IMAC3 Cu ProteinChip technology process50其它联用技术的报道还有 ,将 Cu ( ) 2IMAC 同毛细管电泳和基质增强解析离子化时间飞行质谱连接 ,研究含有组氨酸的胰蛋白酶在金属螯合 Cu ( ) 柱 上 的 选 择 性 行 为26 ; 将 固 定 有 Cu2 + 的 毛 细 管IMAC 柱与电喷雾离子化四极飞行质谱在线联机 ,分离和鉴定了含有组氨酸的胰蛋白酶和其它肽的混合物25;把 Cu ( ) 2IMAC 与其它色谱和质谱技术相结合 ,利用 Cu2 + 螯合剂对组氨酸肽的选择性

39、吸附 ,较大程度地简化了质谱分析前样品的复杂性8 ,55 等 。结 语近几年 ,将 Cu ( ) 2IMAC 和其它分离检测技术如毛细管电泳和质谱分析结合起来 ,使固定 Cu ( )3的 IMAC 方法获得发展 。利用 Cu ( ) 2IMAC 不仅可分离表面带组氨酸的蛋白质分子 ,也可纯化组氨酸标记的重组蛋白 。该法还可将稀释 、脱变性剂 、柱复性以及纯化结合起来 ,使失活的蛋白质得到复性 。利用 SELDI TOF MS2IMAC Cu 蛋白质芯片技术 ,通过分析血清 、组织 、尿液等粗生物样品 ,可筛选出相对特异的潜在生物标记 ,为病变的早期诊断提供了可靠的技术平台 。尽管 Cu ( )

40、 2IMAC 作为蛋白质识别与检测 、分离与纯化的重要工具 ,一直受到生物色谱学家的青 睐 。然而这个方法存在的严重缺陷是 ,用常规流动相 (如含 NaCl 的磷酸缓冲液) 无法洗脱吸附在强配位金属螯合 Cu ( ) 柱上的蛋白质 ,只有通过质子化作用或加入竞争洗脱剂 (如咪唑 、甘氨酸 、组氨酸等) 或将二者结合才能将吸附蛋白洗脱下来 。在这样的操作条件下 ,尤其竞争洗脱剂存在的情况下 ,蛋白质的 洗脱还伴随着 Cu2 + 流失 ,造成柱寿命短 、重现性差 、产品和检测室易被污染 ,甚至无法进行测量 ,严重影响了强亲和金属螯合商品 Cu ( ) 柱的推广和应用 。为了解决这个问题 ,许多科研

41、工作者作了不同的尝试 ,如在流动相中增添少量的 Cu2 + ;选择洗脱强度较低的竞争剂 ;选择不同的络合配基如亚氨基二乙酸 ( IDA) 、甘氨酸 (AAA) 和门冬氨酸 (ASP) 等 ;在金属螯合 Cu ( ) 柱后串联 IDA 裸柱等 ,但都还没能从根本 上解决固定的 Cu2 + 的流失问题 。因此上述问题的解决 ,对开发新型 Cu2 + 螯合剂 ,提高金属螯合 Cu ( )柱对蛋白质的选择性以及扩展金属 Cu2 + 螯合色谱的应用范围 ,都有着十分重要的意义 。参 考 文 献E K M Ueda , P W Gout , L Morganti . J . Chromatogr . A

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