国家自然科学基金申请书 模板.doc

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1、一、立项依据与研究内容（一）项目的立项依据DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统广泛存在于生物体中，它是细胞复制后的一种修复机制1-3。其功能是在含有错配碱基的DNA分子中切除配对错误的片段，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶等的作用，重新合成配对正确的片段，使DNA恢复正常的核苷酸序列。因此，它起着增强DNA复制保真度、修复DNA错配、降低基因变异和维持基因组稳定性的作用4-5。近来，MMR系统的研究越来越受重视，对MMR作用机制及该系统的组成结构与功能分析方面的研究正不断深入6-8。由于在越来越多的肿瘤(如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲

2、状腺肿瘤等)细胞中找到DNA MMR基因突变或缺陷的痕迹9-11。MMR系统与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研究热点，MMR基因也成为继癌基因与抑癌基因之后被确认的第三类肿瘤相关基因4。外源性的持续刺激是细胞复制出现DNA错配的重要原因之一，而日益严重的化学污染又使生物受到的外源毒素刺激与日俱增，生物细胞内DNA损伤与错配几率因而也急剧增加12-15。错配的DNA序列如果不能得到修复，将导致突变频率增加，基因突变事件放大，最终会引起肿瘤等相关疾病的发生发展。事实上，人类MMR系统不仅能识别多种需要进行核苷酸切除与重新合成的DNA错配，还能参与如O6-甲基鸟嘌呤和UV诱导的光产物等造成的D

3、NA损伤的修复16-19。这说明MMR系统极可能参与了暴毒后DNA损伤的修复。另有研究显示，毒物暴露不但会使DNA错配概率显著提高而增加MMR系统的负荷，而且有些致癌物可能会直接损害MMR基因，使MMR活性降低甚至丧失。其中，Feitsma等通过使用强致癌物乙基亚硝基脲来诱变获得MSH2、MLH1、MSH6和PMS2等MMR基因缺陷型斑马鱼就是一个重要的例证20-26。因此，日益严重的环境污染对生物及人类构成的健康风险之一可能就是阻断或干扰细胞的DNA MMR活性。然而，目前将DNA MMR活性分析与环境毒理学相结合的研究在国际上仍为空白，这与当前DNA MMR活性分析方法较为繁琐及环境毒理研

4、究对所需的异源核酸分子的质与量要求很高有关。除了本课题拟开展的活细胞DNA MMR活性分析技术以外，生物体MMR功能的主要分析方法还有两种。第一种是以噬菌体M13mp2及其衍生株为材料27-30，该法利用噬菌体M13mp2及其一种衍生株作为材料，各自提供一条正链ssDNA和一条负链ssDNA，这两条ssDNA退火杂交后可形成一个带预设错配位点的环状异源dsDNA。将这种含错配碱基的异源dsDNA转入自身错配修复功能缺失的宿主菌E.coli(NR9160)，在培养平板上就会出现混合噬斑。若将这种异源dsDNA与样本细胞提取物在体外作用后再次转化NR9162，样本细胞的MMR系统对错配位点的修复情

5、况可通过指示板上的混合噬斑比率的变化来指示，进而分析样本的DNA MMR活性。第二种以寡聚核苷酸为材料31，该法采用人工合成的寡聚核苷酸来制备含有错配碱基的异源dsDNA，在错配碱基处预设特异性限制性内酶切位点如果待测样本的MMR功能完整，其提取物在体外与这种异源dsDNA作用后，在错配碱基得到修后异源dsDNA即变为同源dsDNA,预设的酶切位点也就同步恢复。通过电泳检测修复后的dsDNA的限制性酶切产物的有无和多少来对样本MMR功能做定性或初步的定量分析。 这两种方法自建立后，在一定程度上促进了对DNA MMR功能活性研究的发展，但也都存较大的局限性。首先，这三种方法均为体外法，不能准确反

6、应生物体内的真实状况。其次，分析过程复杂，需要多个步骤，而且指标参数的灵敏度和准确度都较低。由于这些方法仅限于特定生物体MMR活性的体外分析，很难在实际研究中广泛推广，这在一定程度上导致了国内在该研究领域力量比较薄弱的局面。但是，复旦大学的王怡等32曾运用上述第一个方法建立了一个类似的DNA MMR活性体外分析模型，用以对淋巴瘤细胞的DNA MMR活性进行分析。为了克服突破这些限制，美国得州大学孙鲁浙教授领衔的研究团队于2004年提出了一种利用绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作为报告基因直接对活细胞DNA MMR活性进行定量分析

7、的模型33。该模型的原理是构建一对EGFP基因真核表达双链核酸分子，其中一个为碱基序列正确的同源双链核酸分子，可以在细胞中正常地表达EGFP；另一个为带一个错配碱基的异源双链核酸分子，这个错配碱基设计在EGFP基因的起始密码子处。将异源双链核酸分子导入活细胞，如果错配没有修复，细胞就不能表达EGFP。因此，把这对EGFP双链核酸分子平行地导入细胞中，并检测其组间的EGFP表达率与表达强度，就可以评估该细胞株DNA MMR活性的强弱。绿色荧光蛋白的发明及其在生物学研究中的应用获得2008年度诺贝尔奖，将其用于DNA MMR活性的定量检测具有显著的创新意念。但在随后的应用中，人们发现该模型的异源双

8、链核酸分子存在一定的EGFP本底表达(即错配未修复也有一定量的绿色荧光蛋白表达)，原因是细胞内基因的表达并不完全依赖于起始密码子。此外，如何大量得到高纯度核酸分子也是制约该技术应用的一个瓶颈。近来，本课题组通过与孙教授的合作而引入此项技术。目前，本课题组已在此项技术的应用上获得了两项突破：(1)采取无义突变策略(在EGFP基因合适位置引入终止密码子)，建立了一种新的突变型EGFP表达质粒p189，运用质粒p111和p189所获得的异源双链核酸分子彻底消除了该模型EGFP的本底值问题34，达到了能精确区分MMR活性缺失的细胞株和正常的细胞株(见插图)；(2)开发出了一种为该模型大量制备高纯度ss

9、DNA的技术详见前期基础，为此项技术在毒理学及其它领域的推广应用提供了技术保障。本项目拟在前期研究的基础上，为该EGFP双链核酸模型再引入一个红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)基因作为报告基因，构建一个全新的双荧光蛋白基因双链核酸分子(含有同时可表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因)。该模型的技术改进特点是：让双链核酸分子自身多带了一个RFP报告基因，可直接定量指示转染效率，而当前技术需要采用与RFP表达质粒共转染的方法；只需要制备一种带错配的异源核酸底物，无需再制备一种无错配的同源核酸底物；检测过程只需将异源核酸底物导入活细胞中，无需再设空白对照组和同源

10、核酸底物组。由此可见，新模型的思路是将所有参数在一组细胞中同时获得，而原方法的不同参数需要在不同的细胞组中获得。因此，新模型由于所有参数完全同步而具更的精确度与灵敏度，而且还可起到简化分析和提高效率的作用。但是，经过优化的检测模型在细胞毒理学研究方面的前景如何？这就需要进行科学与系统的验证与评估。因此，本课题拟先用已知的强致癌化学污染物乙基亚硝基脲来验证该模型应用于细胞毒性研究的适用性，再用几种已知的具有DNA突变和致癌毒性的化学污染物(如铬(Cr)、镉(Cd)、砷（As）、多氯联苯(PCBs)、多环芳烃(PAHs)和DDT等)及几种毒性较弱的新型持久性有机污染物(如全氟辛烷磺酸(PFOS)、

11、多溴二苯醚(PBDE)和双酚A(BPA)等)来评估该模型应用于细胞毒性研究的优越性。如果活细胞MMR功能活性分析模型可以应用于环境毒理学研究中，我们不仅可为环境污染物的致突变毒性、遗传毒性与致癌毒性的定量评价增加一个强有力的选项，更可以在微观上发掘环境污染物生物毒性的分子机制。主要参考文献：1.Wiesendanger, M., M.D. Scharff, and W. Edelmann, Somatic hypermutation, transcription, and DNA mismatch repair. Cell, 1998. 94(4): p. 415-8.2. Gou-Min L

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29、研究目标，以及拟解决的关键科学问题 1研究内容 (1) 双色荧光蛋白表达质粒的构建：采用双顺反子克隆技术将p111和p189改造成EGFP(绿色荧光蛋白)和RFP(红色荧光蛋白)基因顺反子表达质粒pEGFP-IRES-DsRed和pmtEGFP-IRES-DsRed，使EGFP和RFP处在同一条mRNA上同步翻译，得到的质粒pEGFP-IRES-DsRed可同时表达EGFP和RFP，而质粒pmtEGFP-IRES-DsRed由于EGFP基因上带有无义突变，只表达RFP。(2) 活细胞DNA MMR活性双色荧光核酸表达分析模型的建立：用pEGFP-IRES-DsRed获取ssDNA，与线性化的p

30、mtEGFP-IRES-DsRed退火制备带缺刻的双荧光蛋白基因异源核酸分子，得到的双荧光蛋白基因异源核酸分子在EGFP基因上带有一个T/G错配。用上述所建立的双荧光蛋白基因异源核酸分子转染活细胞，每一个成功转染的细胞都会表达RFP。若该细胞具有错配修复能力，将T/G错配修复后，它就会同时表达EGFP。通过流式细胞仪检测EGFP和RFP表达情况，即可分析活细胞内的DNA MMR活性。(3) 新模型应用于细胞毒理学研究的适用性研究：先用已知的强致癌化学污染物乙基亚硝基脲(具有MMR基因突变毒性)来验证上述建立的活细胞DNA MMR活性检测新模型是否可以应用于细胞毒理学的研究。然后，再用已知的具有

31、DNA突变和致癌毒性的化学污染物(如Cd、As、PCBs、PAHs、DDT等)以及毒性较低且致癌效应不明的新型污染物(如PFOS、PBDE、BPA等)来评估该模型应用于细胞毒理学研究的优越性。2研究目标：通过以上研究内容的实施，本课题将在建立活细胞DNA MMR活性分析新模型的基础上，验证与评估该项技术应用于细胞毒理学研究的前景与优越性。这不仅可为化学污染物的致突变毒性、遗传毒性和致癌毒性的定量评价提供一种新方法，而且还具有推广到癌症发病机制研究等领域的前景，以及在微观上发掘环境污染物生物毒性的分子机制。3拟解决的关键问题(1) 本项目拟构建的双色荧光蛋白表达质粒在表达EGFP基因与RFP基因

32、时，两者必须同步，但又相对独立，一方的表达不会抑制或增强另一方的表达，即两个基因在表达时相互间不会出现拮抗或协同效应。因此，成功构建符合上述要求的双色荧光蛋白表达质粒是本项目的一个关键所在。(2) 如果确认本项目建立的活细胞DNA MMR活性分析新模型在细胞毒理学研究中具有应用前景，这必将为环境毒物致癌与致突变毒性的定量评价开辟一条新途径。此外，由于DNA MMR活性是许多肿瘤疾病发生与发展的诱因，该模型的建立与应用必然可以促进环境污染与疾病发生内在关联研究的进步。(三)拟采取的研究方案及可行性分析1研究方案(1) 双色荧光蛋白表达质粒的构建： 实验材料：EGFP正常表达型质粒p111、无义突

33、变型EGFP质粒p189、双顺反子表达载体pIRES2-DsRed(clontech)、Pfu高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DpnI内切酶、dNTPs(脱氧核糖核苷酸)和引物等。以pIRES2DsRed载体为摸板，设计引物，扩增出含IRES表达元件的RFP基因片段IRES-DsRed，对IRES-DsRed片段进行双酶切与纯化。对质粒p111和p189分别进行双酶切，回收大片段。然后，分别放到两个无菌的1.5ml EP管中，按照1：3的摩尔比例加入双酶切并纯化后的IRES-DsRed基因片段，再加入T4 DNA连接酶，16过夜温育进行连接反应。从两管连接产物中各取10ng分别转染E.

34、coli JM109感受态细菌，涂布LB上选择平板，37过夜培养，筛选长出的单菌落。将单菌落分别接种于LB液体培养基中，37下震荡培养12小时，提取质粒。酶切电泳鉴定后，再测序鉴定，并转染细胞验证。最终获得两种双荧光蛋白表达质粒，即由p111衍生而来的pEGFP-IRES-DsRed(带有野生型的EGFP基因和RFP基因，能在细胞中同时表达产生红绿两种荧光)和由p189衍生而来的pmtEGFP-IRES-DsRed(带有无义突变型的EGFP基因和野生型RFP基因，在细胞内只能表达产生红色荧光)。(2) 活细胞DNA MMR活性双色荧光核酸表达分析模型的建立：实验材料：步骤(1)中构建的双荧光质

35、粒pEGFP-IRES-DsRed和pmtEGFP-IRES-DsRed、缺刻酶Nb.Bpu10I、限制性内切酶BstXI、外切核酸酶Exonuclease、质粒安全性酶PSAD(Epicentre公司产品)等生化试剂。以质粒pEGFP-IRES-DsRed为底物，用缺刻酶Nb.Bpu10I充分酶切，使其模板链(“”链)上出现若干缺刻，紧接着用外切核酸酶Exonuclease完全消化，使其模板链(“”链)完全水解，纯化回收后得到单链环状的pEGFP-IRES-DsRed编码股(“”链)DNA。以质粒pmtEGFP-IRES-DsRed为底物，用限制性内切酶BstXI充分酶切，使其完全变成线性化

36、分子，浓缩回收。将上述中得到的单链环状的pEGFP-IRES-DsRed编码股(“”链)DNA分子与中得到的双链线性的pmtEGFP-IRES-DsRed分子按照1.5:1摩尔比混合置于0.2ml PCR管中，在PCR仪中95高温变性5分钟。取出反应管，室温下自然冷却。冷却反应管中将产生单链环状的pEGFP-IRES-DsRed编码股(“”链)DNA分子与双链线性的pmtEGFP-IRES-DsRed分子中的模板链(“”链)退火杂交形成的带一个缺刻的环状异源双链核酸分子。于反应管中加入PSAD酶，降解去除多余单链分子和双链线性分子，纯化回收后得到高纯度的含双荧光蛋白表达基因的缺刻环状异源双链核

37、酸分子，该核酸分子上的EGFP基因上将存在一个引入的T/G错配。将中得到的核酸分子分别转染MMR活性正常细胞株(如Hela)和MMR活性缺失细胞株(如Rko或HCT116)。用流式细胞仪分析产生红色和绿色荧光的细胞数量及荧光强度，即可用下列公式来定量各株细胞的DNA MMR活性：A = G Gm/R Rm式中A为细胞株DNA MMR活性，G为能表达绿色荧光蛋白的细胞数，Gm为细胞表达绿色荧光蛋白的平均强度，R为能表达红色荧光蛋白的细胞数，Rm为细胞表达红色荧光蛋白的平均强度。这是因为MMR活性正常或缺失的细胞株均会表达红色荧光蛋白，因而红色荧光蛋白的表达率与表达强度即可代表转染较率，但只有具错

38、配修复能力的细胞可表达绿色荧光。因此，绿色荧光蛋白表达值与红色荧光蛋白表达值的比值可用于表达细胞的DNA MMR活性。(3) 新模型应用于细胞毒理学研究的适用性研究：细胞系：DNA MMR活性正常的细胞Hela、SW480和MDA-MB-231。化学污染物：乙基亚硝基脲、Cd、PCBs、DDT、PBDE、PFOS等。毒物工作液配置：溶于DMSO和去离子超纯水中，配成10 mM的工作母液，-20下保存。使用时，将母液用细胞培养液稀释成各种浓度（浓度范围视毒物的毒性而定）的工作液，并用DMSO调整工作液中的DMSO浓度，使其含量均为0.1，DMSO对照液的DMSO浓度也为0.1。细胞培养与暴毒：细

39、胞复苏后用DMEM培养基加10%胎牛血清培养12周，传代。将不同浓度的毒物工作液、DMSO对照液和空白对照液分别添加至细胞培养基中，持续暴毒传代至第三或第四代。转染：采用脂质体介导法将双荧光蛋白异源核酸分子分别导入各组细胞，培养24小时。检测：在荧光显微镜下观察红色与绿色荧光的表达情况，拍照记录。然后，将细胞用胰酶消化，制成细胞悬液后，取样进流式细胞仪检测(每组进样30000个细胞)，获得红色与绿色荧光表达的细胞数和荧光平均强度等参数。按照上述公式A = G Gm/R Rm计算暴毒组、DMSO对照组和空白对照组的DNA MMR活性，即可分析所测化学污染物是否具DNA MMR功能干扰效应。2技术

40、路线3可行性分析 (1) 在前期基础方面，活细胞DNA MMR活性检测技术是本项目组主要成员孙鲁浙教授及其所属研究团队创建的( 见参考文献34)。近来，申请者带领项目组建立一个新质粒p189，彻底消除了原模型EGFP本底值过高的问题( 见参考文献35)，而且也在高纯度核酸分子大量制备技术上取得了突破性的进展。此外，以细胞和斑马鱼作为模式生物的环境毒理学研究是本团队近期的研究重点。这些均为完成本项目的研究内容打下了坚实的基础。(2) 在技术上，拟采用近年来发展起来的双顺反子克隆技术来构建双色荧光蛋白表达质粒，即将EGFP基因和RFP基因通过IRES（内部核糖体进入位点）表达元件连接起来，置于一个

41、共同的启动子下，使EGFP基因和RFP基因在同一条mRNA上转录出来，以解决两个基因的表达需要同步且相对独立的难题。(3) 在工作量上，本研究团队在分子克隆、细胞培养、毒性评价等方面均积累了比较丰富的经验，可在前期摸索等环节节省许多时间。一般来说，用一年多一点的时间来构建与验证新模型应该是足够的，因为我们已在运用分子克隆技术构建质粒和制备异源双链核酸分子上积累了经验。在新模型的适用性与优越性评价上，一种毒物的细胞暴毒过程（34代）只需2周左右，加上转染与流式细胞仪检测，整个过程不会超过3周。考虑到一些必要的工作准备和实验重复，一个人用2个月时间应该能用新模型完成一种毒物的DNA MMR活性负面

42、效应的评价工作。因此，用三年时间来完成本项目的研究内容和达到相应的目标应该是合理的。(4) 在仪器设备上，本项目申请单位拥有先进的BD FACSAria流式细胞仪、Olympus Foluview FV-1000激光共聚焦显微镜、实时定量PCR仪、各种不同容量的冷冻高速离心机、二氧化碳培养箱及其它相关的分子生物学与细胞毒理学研究仪器与设备，完全可以满足本项目的研究所需。(5) 在科学意义上，研究环境污染物对DNA MMR活性的影响，不仅可以定量评价对象污染物的致突变、致癌与遗传毒性，还有助于从分子及细胞水平上阐述毒物的作用机制，可为环境污染物的生态安全与人群健康风险评估提供重要的科学依据。 (

43、四)本项目的特色与创新之处1目前，已知的生物体细胞DNA MMR功能活性分析技术模型非常有限。其中，活细胞DNA MMR活性分析技术在这一领域具有非常高的新颖性。通过本团队的前期优化与技术攻关，该项技术已具备了推广应用的前景。通过双色荧光蛋白表达策略的进一步优化，该项技术有望在精确性、灵敏性、可操作性、经济性等方面大幅的提升，从而在生物体DNA MMR功能分析领域达到世界先进水平。2将活细胞DNA MMR活性分析技术应用于环境污染物的细胞毒理研究，旨在建立起以DNA MMR活性作为新的分子标志物的环境毒理研究新方法。目前尚无将生物体DNA MMR功能活性分析技术应用于毒理学的报道，因而其成果必

44、将具有较高的分创新性和学术价值。3DNA MMR微观上是生物细胞内的一种分子机制，但宏观上却与许多肿瘤等病变的发生发展密切相关。将活细胞DNA MMR功能活性分析技术应用到环境毒理研究中，不仅有望建立环境污染物致癌毒性与遗传毒性的定量评价方法，更可以在微观上发掘环境污染物生物毒性的分子机制。(五)年度研究计划及预期研究结果1年度研究计划科目2010201120121-34-67-910-121-34-67-910-121-34-67-910-12研究方案的设计与研究工作的前期准备双荧光蛋白表达质粒的构建与鉴定双荧光蛋白基因异源双链核酸分子的制备环境污染物DNA MMR干扰效应的分析与评估论文撰写与结题报告等2预期研究成果(1) 建立活细胞DNA MMR活性双色荧光蛋白表达分析新模型，并使其在精确度、灵敏度、可操作性和经济性等方面比原模型有大幅的提高。(2) 发表论文SCI收录论文4篇以上，总影响因子大于8.0。(3) 培养青年科研骨干2人以上，培养硕士4人以上。