修改aczl204 初始污染菌检测方法.doc

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1、编号：AC-ZL-204初始污染菌检测作业指导书版本：A/0起草/修订人审核人批准人日 期日 期日 期颁发号：颁发日期： 年 月 日生效日期： 年 月 日颁发部门：质量部变更记载：新文件。 5.1 原理1.0 目的 建立产品初始污染菌数检验及分析标准操作规程。2.0 适用范围本公司所有包装后灭菌前的每批产品。3.0 参考文献参考中国药典2015版四部非无菌微生物限度检查法GB/T19973.1-2005 GB15980-19954.0 工作程序4.1 设备：恒温培养箱、试管、吸管、培养皿、锥形瓶、量筒、烧杯、镊子、 剪子、橡皮塞、纱布、灭菌棉球、酒精灯，超净工作台，高压灭菌锅，电子天平，接种环

2、等。4.2 稀释液及培养基PH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液胰酪大豆胨琼脂培养基、酪大豆胨液体培养基、沙式葡萄糖琼脂培养基4.3菌种及菌液制备4.3.1 菌种及菌液制备 4.3.2 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代。见菌种保存及传代方法操作，以保证试验菌株的生物特性。计数培养基适用性检查，计数方法适用性检查用菌株见表14.3.3 菌液的制备：按表1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氣化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人35ml含0. 05%

3、 (m l/m l)聚山梨酯8 0的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7. 0 无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0. 9%无菌氣化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。4.3.4 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28C，可在2 4小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28C,在验证过的贮存期内使用。 表1 试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌( St

4、aphylococcus a u reus) C C M C C (B )26 003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3 0 3 5C，培养时间1 8 24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度 3 0 3 5 C ，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法）培养温度3 0 35C，培养时间不超过3 天，接种量不大于lOOcfu铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCMCC ( B )10 104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3 0 35C，培养时间

5、1 824小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基， 培养温度3 0 3 5 C ，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法），培养温度3 0 35C，培养时间不超过3 天，接种量不大于lOOcfu枯草芽孢杆菌.Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3 0 3 5C，培养时间1 8 24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3 0 35 C ，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（

6、M P N 法），培养温度3 0 35C，培养时间不超过3 天，接种量不大于100cfu白色念珠菌(Candida albicans)CCMCC(F)98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度2 0 25C，培养时间2 3 天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3 0 3 5 C，培养时间不超过5 天，接种量不大于1OOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 0 25C,培养时间不超过5 天，接种量不100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（M P N 法不适用），培养温度3 0 3 5 C，培养时间不超过5 天，接种量不大lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 0 25C，培养

7、时间不超过5 天，接种量不大于lOOcfu黑曲霉（Aspergillusniger) C C M C C (F )98 003沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025 C，培养时间57 天，或直到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3 0 3 5C，培养时间不超过5 天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 0 25C，培养时间不超过5 天，接种量不大lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基（M P N 法不适用），培养温度3 0 3 5C ，培养时间不超过5 天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 0 25C，培养时间不超过5

8、天，接种量不大于lOOcfu4.4 阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，应无菌生长。4.5计数培养基适用性检查按表1 规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。4.6 计数方法适用性试验 4.6.1验证方法 验证试验

9、至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.6.2 供试液的制备4.6.2.1 中央螺丝：取供试品10件，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，用漩涡震荡器 1min进行震荡(2800次/分)，让螺丝表面充分洗脱下来，作为1：10供试液。必要时，用同一稀释液将进一步10倍系列稀释。4.6.2.2 基台，覆盖螺丝，植体，包装内瓶，包装内瓶玻璃盖子，包装内瓶塑料盖子供试液的制备同上。4.6.2.3 吸塑盒外表面：将内径为5cmX5cm的灭菌规格板，放在样品的外表面，平行采样10个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子在规格板内涂抹10次（往返计为一次），将棉拭子放入10ml灭菌生理

10、盐水的采样瓶中，用漩涡震荡器 1min进行震荡(2800次/分)，作为供试液。必要时，用同一稀释液将进一步10倍系列稀释。4.6.2.4 吸塑盒内曹：取样品10个，每个内曹加5ml无菌0.9%氯化钠溶液,用无菌玻棒充分搅拌接触，将液体收集在无菌的容器中，充分振荡。必要时，用稀释液做10倍系列稀释。4.6.2.5 特卫强纸：取样品10张，将内径为5cmX5cm的灭菌规格板，放在样品的外表面，平行采样10个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子在规格板内涂抹10次（往返计为一次），将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的采样瓶中，用漩涡震荡器 1min进行震荡(2800次/分)，作为供试液。必要时，用同一稀释液将

11、进一步10倍系列稀释。4.6.2.6 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45C 。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1 小时。4.6.2.7 接种和稀释: 按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。(1)试验组：取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于lOOcfu。（2）供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代

12、替菌液同试验组操作。（3）菌液对照组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。4.7 供试品中微生物的回收4.7.1 方法适用性实验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。微生物的回收采用平皿法的倾注法或薄膜过滤法。4.7.2 平皿法的倾注法4.7.2.1每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。4.7.2.2 倾注法: 取照上述“ 供试液的制备” “ 接种和稀释” 制备的供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注人1520ml温度不超过45熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平

13、皿，培养基的用量应相应增加。规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。4.7.3 薄膜过滤法 4.7.3.1 所采用的滤膜孔径应不大于0.45pm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。4.7.3.2 取照上述“供试液的

14、制备” “ 接种和稀释” 制备的供试液适量（一般取相当于lg 、lm l或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。4.7.3.3 若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1 规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。4.7.4 培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035C培养35 天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025C培养57 天，观察菌落生

15、长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数。4.8 结果判断计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0 .52 范围内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检査4.9 供试品检验4.9.1 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数

16、、霉菌和酵母菌总数的测定。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母总数的测定。4.9.2 阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。4.9.3 平皿法: 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2 个平板。4.9.3.1培养和计数：除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035C培养35 天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025C培养57 天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。

17、菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。4.9.3.2 菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，计算供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告4.9.3.3 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数.4.9.4 薄膜过滤法：除另有规定外，按计

18、数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当于l g 、lm l或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。4.9.4.1 培养和计数： 培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过lOOcfu4.9.4.2 菌数报告规则 以相当于lg 、lm l或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以 1 报告菌数（每张滤膜过滤lg 、lm l或10cm2供试品），或 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。4.

19、10 结果判断：需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氣霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。a)漩涡震荡法：每份样品混合物分别用30S、1min进行震荡(2800次/分) b)活菌计数法进行含菌量测定(见4.1.1.2-C)。 c)每种洗脱液必须做5个样品，以比较不同洗脱回收率,选择回收率最小的为公司产品的洗液。 d)然后再

20、选取2个批次，各5个样品验证,取平均修正系数为每种产品的回收率的修正系数。4.1.1.3.3试验结论a) 营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基按照条件培养。b) 最终回收率的修正系数: (回收率的修正系数1+回收率的修正系数2+回收率的修正系数3)/3经过试验得出：项目实验服口罩手套工具包修正系数(NA)修正系数(RBA)初始污染菌检测4.2.1设备与材料准备设备及无菌操作等可参照有关文件无菌检测方法。4.2.2样品的选择规则每批应随机抽取样品三件。4.2.3实验方法a) 每批产品包装好后取样品1件，根据重量称取1克投入一定量(100ml)0.1%蛋白胨水溶液中，蜗旋震荡30s。b) 取10ml

21、原液加入90ml 0.1%蛋白胨溶液，制成1：10的供试液。再从1：10供试液中取10ml稀释成1：100的供试液。c) 分别取原液、2个稀释级供试液各10ml，薄膜过滤。各做两个平行组。d) 将膜分别直接贴在营养琼脂培养基(NA)和玫瑰红钠琼脂培养基(RBA)上，放规定培养条件下(NA：3035，3d，RBA：2025，5d)培养，进行活菌计数。参照初始污染菌检测报告e) 根据所选洗脱液的洗脱系数计算产品上的初始污染菌。判定标准：每克100CFU(每克不大于100个为合格)。5.0 质量记录 初始污染菌检测报告初始污染菌检测报告编号：QC-ZL-05-01样品名称批号 检测依据初始污染菌检测方法培养基培养温度检测日期报告日期 平皿菌落数10-1 10-210-3培养1d培养2d培养3d培养4d培养5d平均菌落数 校正系数初始污染菌结论符合规定检验员_ 审核_