PCR(级研究生).ppt
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1、Polymerase Chain Reaction(PCR),聚合酶链反应,Department of biochemistry and molecular biology,DNA,生命的蓝图,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,故事发生在1983年的春夏之交,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链,自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶,面对面地合成着DNA,,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链,每次解链后再加
2、入DNA聚合酶进行反应,依次循环。1983年12月,他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,Kary B.Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,由一对引物介导,通过温度的调节,使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA与引物复性(退火)成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链DNA(引物的延伸);这种热变性-复性-延伸的过程,就是一个PCR循环;一般通过2030个循环之后,就可获得大量(106倍)的要扩增的DNA片段。又称为无细胞分子克隆
3、技术、基因扩增技术或DNA扩增技术。Pg水平至ng水平。,第一节 PCR基本原理,一、PCR的基本原理,DNA体外的快速扩增技术,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模
4、板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,第二节、PCR的过程,(一)DNA模板的解链(变性)90 95,30s 理论上,在90 左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开,完全分离为单链;且在中性pH情况下,DNA的完整性仍能很好保存。,(二)DNA 单链与引物的退火(复性)55 65,3045s 引物与模板单链特异性结合(较高的温度);不希望两条互补的模板单链结合在一起(DNA引物的量大大超过模板的量,竞争性结合:引物+模板几率DNA自身复性几率);,(三)
5、引物的延伸(新链DNA的合成)7075,3060s(2kb)首次循环:引物从3端开始延伸,延伸片段的5端为人工合成引物是特定的,3端没有固定的终止点,长短不一。第二个循环:引物与新链结合,由于后者5端序列是固定的末端,意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端的终止点。N个循环后:由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定,产物的序列是介于两种引物5端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,-T,Polymerase Chain Reaction-PCR,Specific sh
6、ort DNA primer anneals to strand to be copied,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*
7、,A,C,G,T,-T,A,C,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T
8、G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,A,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,高度的特异性:引物的限定,高温扩增。高度的敏感性:微量样品(单拷贝基因、单个细胞、一根头发等),高效性(X106)。操作简便快速,易于自动化、程序化,方法稳定。对标本的纯度要求底:纯化或粗制的,新鲜或陈旧的,各种细胞,体液,完整的或降解的DNA。,PCR技术的特点,特异性强,PCR反应的特异性决定因素为:引物与模板DNA特异正确的结合;碱基配对原则;Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;靶基因的特异性与保守性。,灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能
9、将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微克(g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。,简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。,对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR反应,第
10、三节、PCR扩增的基本方法,(一)PCR反应体系1.仪器 台式微量离心机 基因扩增仪 微量塑料离心管:0.5ml或1.5ml(经高压灭菌)微量加样器(pipetman):20P、200P、1000P,电泳仪及电泳槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手套、Tip若干,PCR,Agarose gel electrophoresis,The final product,UV visualisation,3-4 hours,2.试剂与试样:一般选用50100l体积,模板核酸(template如:人基因组DNA 0.1g)扩增引物(primer一对,各0.21mol/L)TaqDNA聚合酶(2.5U)dNTP(
11、四种:各20200mol/L)标准的缓冲液:10X buffer(KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT)无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油:3050ul(封闭、防止高温时液体的挥发),2.PCR反应试剂,(1)模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,(2)引物浓度 0.2-1 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。(3)Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶
12、量过少影响反应产量。,(4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,(5)Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,PCR反应体系,1、10PCR buffer 10l 2、dNTP mix 各200mol/L 3
13、、引物1 1mol/L 4、引物2 1mol/L 5、DNA模板 50ng-1g 6、Taq 酶 2U 7、加双蒸水至总体积为100l,(二)常规PCR的反应条件 预变性:94 300s(高温起动:充分变性,防止非特异性扩增)变性:90-95,30s-60s 退火:55-65 30s-45s 延伸:70-72 30-60s(2kb)25-35次cycle后,延长延伸(72,10min;充分延伸),冷却至4 或加入EDTA至10mmol/L以终止反应。,(三)PCR基本操作程序1.加样(1)向一微量eppendorf离心管(壁薄、管底扁平、深度适宜)中依次加入:10 x PCR buffer、d
14、dH2O、dNTPs、Primers;102-105个copy 的DNA样品;Taq DNA聚合酶0.5l(混匀后,离心);加入石蜡油。2.上机:设置循环程序,进行扩增。3.PCR产物电泳:凝胶的制备;点样与电泳;观察结果;作好记录或摄影,保存好实验结果。,(四)PCR 扩增产物的分析,Gel electrophoresisRestriction endonucleaseMolecular hybridizationNucleic acid sequence,PCR扩增产物的电泳分析,琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测(定性)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中可用于科研及检测分析,琼
15、脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为6265,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收,质粒与外源性DNA的快速连接等,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)Tris-乙酸(TAE)Tris-磷酸(TPE)TBE与TPE:缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀TAE:缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TAE。缓冲液中的 ED
16、TA 可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂:溴酚兰二甲苯青溴酚兰:在碱性液体中呈紫兰色电泳中,溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段,核酸电泳的染色剂,溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5g/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般5ng溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察,酶切分析
17、,根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后,获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究,PCR-RFLP,分子杂交,检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR 产物碱基突变的有效方法主要的杂交 Southern印迹杂交斑点杂交,Southern印迹杂交:,在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记(探针)与 PCR 产物杂交此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测 PCR产物的灵敏度。,斑点杂交:,将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异分析,RDB检测-地中海贫
18、血突变基因,-29(AG)-28(AG)17(AT,AAG TAG)E(CD26 GAG AAG)IVS-I-1(GT)IVS-I-5(GC)27-28(+C)41-42(-CTTT)43(GT)71-72(+A或+T)654(CT),微孔板夹心杂交法,通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交,使PCR产物间接地固定于微孔板上,然后,再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交,漂洗后显色即可判断结果该法使用了两个杂交过程来检测一个产物,其特异性较一次杂交的检测法高,Principle,:NOS(11014/cm2)N-羟化琥珀酰亚胺酯,Princi
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