药学分子生物学翻译.ppt

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1、,第十二章 蛋白质的生物合成翻译,第三篇 基因信息的传递,蛋白质的生物合成翻译,蛋白质的生物合成，即翻译，就是将核酸中由 4 种核苷酸序列编码的遗传信息，通过遗传密码破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的排列顺序。,中心法则：,蛋白质生物合成的过程,翻译起始、延长、终止翻译后修饰三维结构的折叠、一级结构的修饰、空间结构加工成熟蛋白质的定向运输信号肽,参与翻译的物质包括：,三种RNAmRNA（messenger RNA,信使RNA）rRNA（ribosomal RNA,核糖体RNA）tRNA（transfer RNA,转移RNA）,20种氨基酸(AA)作为原料酶及众多蛋白因子 ATP、G

2、TP、无机离子,一、翻译模板mRNA及遗传密码,mRNA是遗传信息的携带者,mRNA含有从DNA转录的遗传信息，是蛋白质合成的模板。mRNA包括5-非翻译区(5-untranslated region,5-UTR)开放阅读框架区(open reading frame,ORF)3-非翻译区(3-untranslated region,3-UTR),一、翻译模板mRNA及遗传密码,原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron)。真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子(single cistron)。,顺反子(cist

3、ron):遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,遗传密码子(genetic coden),mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为遗传密码、密码子（coden），也称三联体密码(triplet coden),起始密码(initiation codon):AUG,终止密码(termination codon):UAA，UAG，UGA,遗传密码表,遗传密码的特点,1、连续性(commaless)编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码中间无标点，连续阅读，密码间既无间断也无交叉,开

4、放阅读框架(open reading frame,ORF)：从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架。,框移突变(frameshift mutation),基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变,mRNA editing,特定的碱基插入、缺失或置换，使同一mRNA前体翻译出序列、功能不同的蛋白质，这种基因表达调节的方式叫做mRNA编辑,遗传密码的特点,2.简并性(degeneracy)有多个密码子特异地编码同一个氨基酸遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2

5、、3、4个或多至6个三联体为其编码。意义：减少有害突变，保证遗传的稳定性不同生物对密码的使用有“偏向性”,简并性(degeneracy),遗传密码的特点,3、方向性(direction)mRNA分子上由起始密码AUG开始，从53方向阅读密码子，直至终止密码4、通用性(universal)已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先,遗传密码的特点,5、摆动性(wobble)转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动性,U,密码子、反密码子配对的摆动现象

6、,二、tRNA是氨基酸的转运工具,双重作用：以氨基酰-tRNA的形式携带活化的氨基酸识别mRNA上的遗传密码，带活化氨基酸对号入座,反密码环,氨基酸臂,tRNA的三级结构示意图,三、核糖体是蛋白质合成场所,原核生物核糖体 70S 真核生物核糖体 80S,核糖体的组成,不同细胞核糖体的组成,核糖体在蛋白质合成中有主要作用：,核糖体通过将mRNA、氨基酰-tRNA和相关的蛋白因子放置在正确的位置来调节蛋白质的合成。核糖体的成分可催化翻译过程的一部分化学反应,三、核糖体RNA是蛋白质合成场所,小亚基：容纳mRNA结合起始tRNA结合、水解ATP大亚基：三个tRNA的结合位点A位：接受位（accept

7、or site）P位：肽酰tRNA占据的位置（peptidyl site）E位：空载tRNA位（exit site）催化肽键形成结合IF、EF、RF等因子,小结：蛋白质生物合成的体系,原料：20种氨基酸模板：mRNA场所：核糖体（核蛋白体）氨基酸的“搬运工具”：tRNA酶与蛋白质因子：EF、IF、RF等因子能量：ATP、GTP无机离子：Mg2+,K+,蛋白质生物合成的过程翻译,（一）氨基酸的活化与转运（二）核糖体循环肽链合成的起始肽链的延长肽链合成的终止,（一）氨基酸的活化与转运,氨基酰-tRNA合成酶催化活化反应在氨基酸的羧基上进行,氨基酸的活化,第一步,氨基酸 ATP 氨基酰-AMP AM

8、P PPi,氨基酸的活化,第二步,氨基酰-AMP tRNA 氨基酰-tRNA AMP,氨基酰-tRNA,氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet 起始肽链合成的氨基酰-tRNA真核生物：Met-tRNAiMet原核生物：fMet-tRNAifMet（N-甲酰甲硫氨酰-tRNAMet）,fMet-tRNAifMet的生成：,蛋白质合成中mRNA模板的方向：5 3蛋白质的合成方向：N端 C端蛋白质合成过程：起始 延长 终止,（二）核糖体循环（ribosome cycle）,活化的氨基酸，由tRNA携带至核糖体上，以mRNA为模板合成多肽的过程

9、,1.翻译的起始,I.原核生物：起始复合物的形成过程（1）核糖体亚基的拆离（2）mRNA与30S小亚基结合（3）fMet-tRNAifMet的结合（4）50S大亚基的结合,起始复合物的形成过程,（1）核糖体大小亚基分离,IF-3,IF-1,（2）mRNA在小亚基定位结合,IF-3,IF-1,S-D序列：原核生物mRNA 5端起始密码子的上游有一段富含嘌呤的 特殊序列，可被核糖体小亚基16S rRNA 3端（富含嘧啶）序列辨认结合,S-D序列 和 rpS辨认序列,（3）起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAiMet)结合到小亚基,IF-3,IF-1,（4）核糖体大亚基结合，起始复合物形成,IF-

10、3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,起始复合物的组装的全过程,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,II.真核生物翻译起始复合物形成,真核生物起始复合物的形成可分为3个步骤：43S前起始复合物形成：起始氨基酰-tRNA结合 48S前起始复合物形成：mRNA在核糖体小亚基就位 80S起始复合物形成：核糖体大亚基结合,真核生物翻译起始因子,真核生物翻译起始复合物形成过程,真核生物翻译起始的特点核蛋白体是80S；起始因子种类多；起始tRNA的Met不需甲酰化；mRNA的5帽子和3poly A尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关；起始tRNA先与核蛋白体小亚基结合，然后再结合m

11、RNA无S-D序列，有Kozak共有序列（ACCAUGG）,2.肽链的延长,指根据mRNA密码序列的指导，按次序添加氨基酸，从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程,肽链延长在核糖体上连续性循环式进行，又称为核糖体循环(ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步：进位(entrance)成肽(peptide bond formation)转位(translocation),肽链合成的延长因子,肽链的延长,（1）进位(entrance)指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核糖体A位在延长因子EF-T的介导下，相应氨基酰-tRNA完成进位,延长因

12、子EF-T的循环：,EF-T的两个亚基：EF-Tu：GTP酶EF-Ts：GTP交换蛋白,进位(entrance),肽链的延长,（2）成肽(peptide bond formation),是由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。,肽链的延长,（3）转位(translocation),延长因子EF-G有转位酶(translocase)活性，可结合并水解1分子GTP，促进核糖体向mRNA的3侧移动。,肽链的延长,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,II.真核生物延长过程,3

13、.肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核糖体等分离，这些过程称为肽链合成终止,只有释放因子（RF）能识别终止密码子，并占据A位,释放因子(release factor,RF),原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 释放因子的功能一是识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核糖体上释放。,RF,原核生物蛋白质合成的能量计算氨基酸活化：2个PATP起始：1个GTP延长：2个GTP终止：1个GTP结论：每合成一个肽

14、键至少消耗4个P。,多聚核糖体(polysome),使蛋白质合成高速、高效进行,电镜下的多聚核糖体现象,蛋白质合成后加工和输送Posttranslational Processing&Protein Transportation,第 三 节,三、翻译后的加工,从核糖体释放出的新生多肽链不一定具备蛋白质生物活性，需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括：,多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰高级结构修饰,三、翻译后的加工,新生肽链的折叠新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N端在核糖体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，

15、产生正确的二级结构、模体、结构域到形成完整空间构象。一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,分子伴侣(molecular chaperon)蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)肽-脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI),1.热休克蛋白(heat shock protein,HSP)HSP70、HSP40和GreE族 2.伴侣素(chaperonins)

16、GroEL和GroES家族,分子伴侣,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,伴侣蛋白的主要作用为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,蛋白二硫键异构酶,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连

17、接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,三、翻译后的加工,一级结构的修饰肽链N端的修饰切除N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸个别氨基酸的修饰形成二硫键，赖氨酸、脯氨酸羟基化，丝氨酸、苏氨酸磷酸化，组氨酸甲基化，谷氨酸羧基化多肽链的水解修饰去除某些肽段或氨基酸残基,HCV genomes,C Rice,2007,Naure Revie

18、ws,p7:putative ion channelNS5A:phosphoprotein,三、翻译后的加工,高级结构的修饰亚基聚合辅基连接疏水脂链的共价连接,形成蛋白质的四级结构 如，血红蛋白（四个亚基构成，分别为两个亚基和两个亚基）,蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。信号序列（signal sequence）：所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一疏水的肽段称为信号序列,靶向输送蛋白的信号序列或成分,（一）分泌蛋白的靶向输送,真核细

19、胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网。,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。,信号肽的一级结构,碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸）,中性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸）,极性氨基酸（甘、丙、丝）,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,（二）线粒体蛋白的靶向输送,（三）细胞核蛋白的靶向输送,蛋白质生物合成的干扰和抑制Interference&Inhibition of Protein Biosynthesis,第 四 节,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质

20、生物合成过程而起作用的。可针对蛋白质生物合成必需的关键组分作为研究新抗菌药物的作用靶点。同时尽量利用真核、原核生物蛋白质合成体系的任何差异，以设计、筛选仅对病原微生物特效而不损害人体的药物。,四、蛋白质生物合成与医学,抗生素(antibiotics)是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,抗代谢药物指能干扰生物代谢过程，从而抑制细胞过度生长的药物，如：6巯基嘌呤（6-MP）。,某些毒素也作用于基因信息传递过程。,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,嘌呤霉素作用示意图,二、其他干扰蛋白质生物合成的物质,毒素(toxin)干扰素(interferon),白喉毒素(diphtheria toxin

21、)的作用机理 使eEF2发生ADP糖基化,白喉毒素,+,+,干扰素的作用机理（1）,干扰素诱导eIF2磷酸化而失活,2.干扰素诱导病毒RNA降解,第三部分,Translation Control,翻 译 调 控,翻译水平调节,蛋白质分子的自我调节作用于自身mRNA的翻译autogenous control,自我控制小分子RNA对翻译的调节siRNAmiRNA,一、翻译起始因子的磷酸化调节蛋白质合成,条件变化活化了特殊的蛋白质激酶，使真核（翻译）起始因子eIF-2（eukaryotic initiation factor，eIF-2）磷酸化所致。,二、结合mRNA 5与3非转录区的蛋白质介导负翻

22、译调控,一些转录抑制蛋白质结合到mRNA的5端抑制转录起始，而另一些抑制蛋白质则识别特殊mRNA分子的3UTR，通过干扰3poly(A)尾与5端帽的联络而减少翻译的起动。,IRE-BP对铁蛋白mRNA翻译的调节,低铁状态,三、细胞浆poly(A)的添加可以调节蛋白翻译,在一些情况下，特殊的poly(A)尾端可以在细胞浆得以延伸。,例：正在成熟中的卵母细胞与卵细胞,一些存在于细胞浆的mRNA分子的3末端只有10-30个腺苷酸（A），它们并不翻译。在卵母细胞成熟和受精后的一个特定时段，当需要这些mRNA 所编码的蛋白质时，poly(A)被添加到这些选定的mRNA分子，大大促进它们翻译的开始。,四、

23、无义变化介导的mRNA降解是真核细胞mRNA监视系统,无义变化介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD）,当在同一阅读框架内的翻译终止密码子UAA、UAG或UGA提前出现在最后两个外显子交界处上游约50 nt处时，mRNA被迅速降解。这些错位终止密码子被称为成熟前终止密码子（premature termination codons,PTC），可以来自突变、重组、不完全或不正确剪接。,无义变化介导的mRNA的降解,意义：,可以使某些异常的mRNA在被有效地翻译成蛋白质前得到清除，这个mRNA监视系统可以防止非正常截短的蛋白质的合成。,NMD在进化过程中

24、发挥了重要作用，使真核细胞更容易探究由于DNA重排、突变或不同剪接方式所形成的新基因。,免疫系统细胞的发育过程中也很重要，重排基因产生的这类mRNA被NMD系统迅速降解，避免了截短蛋白质的细胞毒作用。,RNA干涉（RNAi）,安德鲁法尔（2006年3月14日）,克雷格梅洛（2006年3月14日）,RNA干涉可以使转录后的基因沉默,RNA干涉,在高等真核生物中发现有一类小RNAs(small RNAs)介导的特殊基因的沉默。这是由于此类小RNAs与mRNAs（经常是3UTR）相互作用，导致mRNA降解或者翻译抑制，使mRNA及其相应基因无法表达而沉默（silence）。,控制至少某些生物体的适时

25、发育。它也是一种保护生物体免受RNA病毒侵袭和控制转座子活性的机制。,意义：,RNAi发现的过程,RNAi现象早在1993年就有报道：将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义R

26、NA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。,RNAi的作用机理,首先是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。,microRNA,microRNAs(miRNAs)是一种大小约2123个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工

27、后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。miRNAs参与调控基因表达，但其机制尚在进一步研究当中。第一个被确认的是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。,microRNA在核内的加工,机制（可能）,miRNA 转录前体(Pri-miRNA)首先在核内被 Rnase 核酸酶 Drosha 加工成约70个核苷酸长的发夹状的 RNA在 Exportin5 的帮助下从核内进入胞质内在 Dicer 酶的作用下，单链的 miRNA 进入一个核糖蛋白复合体 miRNP（RISC）。miRNA 通过与靶基因的

28、3 UTR 区互补配对，指导 miRNP 复合体对靶基因 mRNA 进行切割或者翻译抑制。MiRNA 到底是抑制还是切割取决于 miRNA 与靶序列互补配对的程度，互补配对高的可能进行切割，而配对低的就只是抑制。植物的 miRNA 与靶基因配对程度高多数是进行切割，而动物中 miRNA 与靶序列的配对性不好，多数进行翻译抑制。,第二套机制（可能）,纽约大学的研究人员利用miR125b和let-7这两种代表性的miRNAs发现哺乳动物细胞与miRNAs部分互补的mRNAs的浓度降低了，而且这种作用是由于加速的脱腺苷化（deadenylation）：miRNAs迅速的将mRNAs上poly（A）尾

29、巴脱去，造成了mRNAs整个片段的降解，从而导致基因无法表达。这种由miRNAs引起的mRNAs脱腺苷作用导致的基因表达受阻与阻碍mRNAs翻译成蛋白质不同，而且与研究人员表示这中作用与siRNAs（RNA干扰）通过完全互补得到的内切酶作用也不相同，这可能也就是miRNAs与siRNAs产生了on target和off target的问题的原因之一。,miRNA 与siRNA使靶mRNA沉默机制,Anti-miRNA oligonucleotides(AMOs):ammunition to target miRNAs implicated in human disease?JWeiler,JH

30、unziker and JHall,蛋白质降解速率的调节,不同的蛋白质半衰期差别很大成熟蛋白N端第一个氨基酸对其寿命很重要蛋白质降解的两条途径：溶酶体途径不依赖ATP，溶酶体中进行泛素化依赖ATP，细胞质中进行,复习思考题：1.概念：（1）翻译（2）遗传密码（3）密码的摆动性（4）氨基酸活化（5）SD序列（6）信号肽（7）分泌性蛋白质（8）靶向输送（9）多聚核蛋白体2.简述RNA在蛋白质合成中的作用。3.简述蛋白质生物合成的大体过程。,4.原核生物和真核生物的翻译起始复合物的生成有何异同？5.简单介绍信号肽假说的具体内容。6.按下列DNA单链5TCGTCGACGATGATCTTCGGCTACTCGA3试写出：（1）DNA复制时另一条链的碱基顺序；（2）以此为模板，转录成mRNA的碱基顺序；（3）所合成肽链的氨基酸顺序。7.比较miRNA 和 siRNA的异同点,