第二章菌种选育课件.ppt

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1、第二章 菌种的选育、保藏与复壮,第一节、微生物工业用菌种第二节、菌种的来源第三节、菌种的选育第四节、菌种保藏第五节、菌种的提纯与复壮,第一节、微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求 微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。发展趋势：从野生型 变异株 自然选育 代谢控制育种 诱变育种 基因工程定向育种,（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）,微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：,（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异

2、退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全,二、工业上常用的微生物,微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过4050种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种举例：,1、常用的细菌,大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。,乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作,枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶,2、酵母菌,种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母

3、红酵母、面包酵母。应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪。,啤酒酵母,红酵母,面包酵母,3、霉菌,曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶,应用：酱油、酱类（淀粉酶）,应用：生产甲义丁二酸,米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲,毛 霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作,根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒,青霉菌,4、放线菌,种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素,其他生物：A:担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类生物。担子菌资源的利

4、用正愈来愈引起人们的重视，如多糖、抗癌药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。,B：病毒(virus)其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。,人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome AIDS）,噬菌体（phage）是病毒的一种。噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分

5、为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。,C：藻类（alga）：培养螺旋藻，每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。,藻 类 工 厂,第二节 菌种的来源,一、微生物选择性分离方法含微生物材料的选择材料的预处理所需菌种的分离菌种的培养菌种的选择和纯化,1、含微生物材料的选择微生物主要来自土

6、壤寻找已经适应苛刻环境压力的微生物类群例如：从盐场分离嗜盐链霉菌，从污泥中分离甲烷菌，从酒糟中分离酵母菌等。,2、材料的预处理通常采用热处理方法减少材料中的细菌数，但许多放线菌的繁殖体，孢子(如链霉菌)和菌丝片段(如红球菌)比G(-)细菌细胞耐热。加热虽然能减少细菌同放线菌的比例，但也常减少放线菌的数目。采用膜过滤法浓缩水中的细胞。然后将滤膜置于培养基的表面，放置乃个小时后移去，或一直留在上面，如处理放线菌繁殖体含量很低的海水,有人先将样品离心然后才过滤。,收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行，并可用简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击在培养基的平板上，

7、这样可以减少分离平板中的细菌数目。在分离前添加一些固体基质(如把几种基质加在土壤中)或洒些可溶性养分来强化培养基。所谓诱饵技术是将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。有人曾广泛使用石腊棒技术来分离诺卡氏菌，从土壤中分离耐酸放线菌。近来,用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌，其中有些新种或亚种。,3、所需菌种的分离分离效率取决于培养基的养分、pH、加入的选择性抑制剂。广泛应用的三种培养基即几丁质琼脂、淀粉一酪素培养基和M3培养基。,因大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH常在6.7-7.5之间。如要分离嗜酸放线菌，pH宜降低到4.5-5.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜

8、碱链霉菌，它不能生长在低于pH 6.1-6.8的条件下，估计嗜碱性放线菌也可能存在于其它碱性环境中。在分离培养基中广泛采用加入抗生素的方法，来增加选择性。,4、菌种的培养放线菌：25-30。多数放线菌是好气的，因此必须保证足够的通气量；多数放线菌的最适生长温度为23-37，高温放线菌的生长温度范围在50-65。嗜热菌：45-55。它能够产生耐热性蛋白质，在高温条件下，普通生物的蛋白质就会失活、变性，但是嗜热菌蛋白质不会变性，生命活动也不会终止。嗜冷菌：4-10。嗜冷菌是指那些能在低于7时可以生长繁殖的细菌，例如假单胞菌黄杆菌、产碱杆菌和色杆菌属等。,5、菌落的选择铺菌法 于分离平板上铺上一层单

9、一的试验菌的办法用来测定各个菌落的抗生素生产能力。复印平板法 将菌落复印在平板上的办法来研究它们对一系列试验菌的作用。这两种方法都有缺点。铺菌法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上一种试验菌。菌落复印平板法对不长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。,二、重要工业微生物的分离方法 施加选择压力的分离方法：1、富集液体培养：指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。要领：给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌群生长的条件。e.g.供给特殊的基质或加入某些抑制剂。,注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其他微生物生长。解决办

10、法：把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基中可以重新建立选择压力，重复移植几次后，将富集培养物再接到固体培养基上。,、固体培养基培养：常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。e.g.碱性蛋白酶的分离用不同pH的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在pH为910的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面。碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白，产生一清晰圈。,随机分离方法：1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）；3、加入缓冲液以减少pH的变化

11、；4、确定含有所需的辅助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等。,抗生素生产菌的筛选：把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。也可以将微生物分离株生长在液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。,药理活性化合物生产菌的筛选：一种化合物如果能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生产菌。,生长因子产生菌的筛选：通过观察分离菌能否促进营养缺陷型（auxotroph）的生长，便可检出生长因子产生菌。,多糖生产菌的筛选：从制糖工业的废水中可获得分离株，在适当的培养基中生长，可从菌

12、落的粘液状外观识别这类产生菌。,第三节、菌种的选育,一、自然选育1、采样采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。,2、增殖培养 方法：控制培养基成分 控制培养条件 抑制不需要的菌类3、纯种分离划线法：简单、快捷。稀释法：菌落单一均匀。

13、,接种针先以火焰灭菌法灭菌,步骤一,固体培养基四区划法接种法介绍如下：,轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却,步骤二,以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。,步骤三,更换一个新的无菌营养平板,步骤四,将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。,步骤五,重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。,步骤六,由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。,步骤七,重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。,步骤八,重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。,步骤九,在营养平板上贴好标签，标示好接种日

14、期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。,步骤十,需要使用的仪器震荡机,固体培养基的稀释涂抹接种法,吸取准备好欲稀释的菌液,吸取充分均匀后的菌液,取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。,将试管于震荡机上，使菌液混合均匀,取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。,从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。,将三角玻璃棒浸于酒精中,将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）,使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天

15、观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。,4、生产性能的测定 一般采用两步法：初筛：以量为主 复筛：以质为主,二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。,诱变剂,物理：紫外线，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,生物：噬菌体,诱变育种的主要环节（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株筛选,按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的目的。诱变原理：诱变育种一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的

16、DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。,原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液 活菌计数诱变处理 诱变处理预备实验 处理液活菌计数平板分离 形态变异并计算其变异率斜面培养 初筛、复筛 自然分离和再复筛 保藏及扩大试验,诱变育种,出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变操作（包括诱变剂量的选择）突变株的筛选 突变高产菌的表现及筛选条件的配合 形态突变 高产突变 耐药性突变 营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变,形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变型。生化突变型：没有形态效应的突变型，如营养缺陷型。致死突

17、变型：生活力下降的突变型。条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件下是致死的突变型。营养缺陷型突变株：由于代谢障碍而成为必须添加某种物质才能生长的突变株。温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下不能生长的突变型。,出发菌株选择应考虑的问题,出发菌株的稳定性选用具备优良特性的菌株挑选对诱变剂敏感的菌株注意菌株的生理状态及生长发育时间,出发菌株 野生菌株 自发突变后获得的高产菌株 已经诱变过的菌株,菌悬液的制备 单细胞悬浮液：106个/mL 孢子悬浮液：108个/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件筛选：选择合适的筛选方法,紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波

18、长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,三、杂交育种 两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型；基因重组

19、可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。,1、细菌的杂交细菌的杂交行为是于1946年首次在大肠杆菌K-12菌株中发现并证实的。首先在大肠杆菌K-12菌株中诱发一个营养缺陷型(A-)、不能发酵乳糖(Lac-)和抗链霉素(SMr)以及对噬菌体Tl敏感的突变体，可以写成A-B+Lac-SMrTs1；另一菌株诱发成一个营养缺陷型(B-)，能发酵乳糖(Lac+)，对链霉菌敏感(SMs)和抗噬菌体Tl的突变体A+B-Lac+SMsTr1。,这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，如果把大约105/ml浓度的上述两种菌株混合在

20、一起，并接种在基本培养基上，则能长出少数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个特制的U型管的两端去培养,中间用一片可以使培养液流通,但不能使细菌通过的烧结玻璃隔开,那么在基本培养基上就不会出现菌落。,这说明细胞的接触是导致基因重组的必要条件，即细菌通过接合完成了杂交行为。在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现了接合现象，但是至今未在革兰氏阳性菌中发现接合现象。,2、放线菌的杂交育种放线菌的基因重组于1955年至1957年首先在天蓝链霉菌中发现，以后在其它科、属、种中相继发现。现在常用的放线菌杂交方法主要有三种：混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。国外在金霉素、土

21、霉素、新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有过成功的报道。,3、霉菌的杂交育种霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。霉菌的杂交育种的步骤为：第一选择直接亲本。用来进行杂交的两个野生型菌株叫原始亲本。假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本,就叫直接亲本。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态突变型等。,第二是异核体的形成。在基本培养基上,强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。,第三是双倍体的检出 检出双倍体的方法有很多种，如用放大镜观察异核体菌落表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，

22、即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体。或者将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上从中长出野生型原养性菌落，将其挑出分离纯化，即得杂合双倍体。,第四是分离子的检出。可以用选择性培养基筛选分离子，也可以将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。,四、原生质体融合步骤：标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。原生质体的融合与再生：两原生质

23、体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合。,2、特点及应用：原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法，霉菌与放线菌已达10-110-2，细菌与酵母已达10-510-6。原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，因此有利于不同种属间微生物的杂交。已报道的丝状真菌种间的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母饰针复膜孢酵母，酿酒酵母彭贝裂殖酵母等。,重组体种类较多；遗传物质的传递更完整；采用温度、药物或紫外线照射灯处理钝化一方的亲株原生质体，再融合，可以提高筛选频率；可以把原生

24、质体融合与其他育种方法结合起来，提高筛选效率。,五、DNA重组技术目标DNA片断的获得与载体DNA分子的连接重组DNA分子引入宿主细胞从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞,基因重组,质粒的特点,1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。2、每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。不同类型的质粒其拷贝数各异，有严紧型和松弛型两种。3、质粒DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价、闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于一条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。,作为载体的质粒的要求,能自主复制有明显筛选标记有内切酶酶切位点以多拷贝形式存在含有

25、启动子，有利于外源基因表达能在宿主中稳定的遗传,质粒DNA的提取方法,细菌培养和质粒扩增；细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取。,重组DNA中常用的工具酶,限制性核酸内切酶：平头连结（不常用）、黏端连结（常用）DNA连接酶DNA聚合酶逆转录酶等,限制性内切酶的剪切方式,宿主细胞必须符合以下条件,对载体的复制和扩增没有严格的限制；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；重组缺陷型，不会产生体内重组；容易导入重组DNA分子；符合重组DNA操作的安全标准。,重组DNA导入宿主菌,体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采

26、用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。,1、转 化,指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。,2、转染和感染,利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程

27、统称为转染。,3、重组克隆的筛选与鉴定,基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。,第四节、菌种保藏,工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有所不同。工业微生物菌种保藏，是要使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，力求把衰退现象推迟减缓到最低限度。,1、菌种保藏原理,菌种保藏共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条

28、件下保藏。如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。,在低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。快速降温，胞内很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。,低温保藏法 低温定期移植法 石蜡油低温保藏法 干燥保藏 甘油管保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保存,现行的菌种保藏方法有下列诸种:,一、低温保藏法,这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢

29、子，可以放在4冰箱内保藏，一般不超过12个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。,二、低温定期移植法,把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，一般36个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养。穿刺培养是将含0.60.8的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。,斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷:即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易

30、于污染杂菌因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。,三、石蜡油低温保藏法,本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-44下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。,菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121高压蒸汽灭菌12h，将其放烘箱中(160左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。,操作：,四、干燥保藏,干燥法是使菌处于干燥

31、条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。,1、沙土管法,取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH中性，烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121灭菌1h，也可用1702h干热灭菌，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可

32、使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.30.5ml，用接种环将其混合均匀。,将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。,在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)。对利福霉素、卡那霉

33、素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。,2、滤纸保藏法,本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。方法是3#滤纸剪成5mm50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。,3、大(小)米保藏法,是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。,五、甘油管保藏法,本法也是利用微生物在甘油中

34、生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与菌悬液充分混匀，使甘油浓度约为40%，于-20下冻存。,六、真空冷冻干燥法,真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保

35、藏方法。,冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细甩悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。,1、冷冻干燥的基本原理 即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。2、设备 冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-4040。,3、操作方法(1)安瓿

36、管准备 选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡810h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗23次，烘干；贴好菌号及日期的标签，管口塞好棉塞，灭菌备用。,(2)保护剂的选择及制备 一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。,(3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加23ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。,(4)预冻

37、 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-30-40下冻结2060min，也可以用干冰和无水乙醇冻510min。,(5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30以下，并尽快使真度达到66Pa以下，可升温以加速水分升华，升温不宜过快，以免引起样品融化。干燥时间以样品最终水分含量达到1%3%为准。冻干样品呈酥块工松散片状。干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封。,(6)保藏及冻干管的启用 密封好的冻干管在4或-18下保藏。需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎

38、管口，加入0.30.5ml液体培养基溶解冻干菌块成为悬液，用无菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基进行培养。,（1)菌的质量 保藏的菌种应在营养丰富的最适条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。,注意事项：,(2)保护剂 一般情况下，那些容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻。如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时死亡率大大减少。,（3）干燥速度 实验表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青

39、霉菌6h干燥存活率为67.3%，而3h为59%。（4）空气的影响 冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存。,（5）温度的影响 可以在室温下保存，但许多微生物在4保存的存活率要比在室温下高1倍。（6）含水量的影响 水分含量过高对菌存活不利，完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在3%以下(1%3%)。,(7)复苏培养 打开安瓿管后加入无菌水使冻干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌种能否适宜冻干保存，需经过实验来证明。冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌放线菌真菌藻类，而菌丝体不宜用此法保存。,七、液氮超

40、低温保存,本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达-196，在这种情况下可以长期保存。,1、保护剂 与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要有保护物质，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感，效果不佳，可选用其他保护剂，常用的有5%10%(V/V)二甲基亚砜；20%二甲亚砜加1%蛋白胨；吐温80及0.4

41、mmol聚乙烯氮戊环等，糖类也可作为一种保护剂，但浓度适当加以控制。,2、操作程序(1)安瓿管-160烘干，加棉塞灭菌备用。(2)菌种准备 在最适培养基斜面上培养得到健壮菌种，制成悬浮液，如为不产孢子的真菌，则采用斜面或液体振荡培养，制成菌丝片段。将菌悬淮分装至灭菌安瓿管中，每管0.20.5ml，然后用火焰将安瓿熔封。,（3)冻结 将熔封后的安瓿管放慢速冻结器上，以每分钟下降1的速度冷冻，当安瓿管温度下降至-35时，即可把安瓿管移入液氮内作长期保藏。(4)菌种的复苏培养 直至全部溶化为止，当溶化后即开启安瓿移至培养基内培养，扣作时应特别注意安全，防止爆炸或冻伤，不宜戴线手套，要戴皮手套操作。,

42、第五节、菌种的提纯与复壮,一、菌种的提纯二、通过寄主体进行复壮 三、淘汰已衰退的个体,一、菌种的提纯,即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。,菌种提纯：一是只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。另一类方法，可达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。,二、通过寄主体进行复壮,对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降

43、低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。,三、淘汰已衰退的个体,通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。,国内外菌种保藏机构,菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。,普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）工业

44、微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京,美国标准菌种收藏所（ATCC）美国冷泉港研究所（CSH）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）日本东京科研化学有限公司（KCC）日本大阪发酵研究所（IFO）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）美国国立卫生研究所（NIH）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）,思考题,常见菌种保藏方法有哪些，各有什么特点？菌种选育方法有哪些？如何进行菌种的提纯与复壮？,