第三章基因克隆载体课件.ppt

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1、章基因克隆载体,第二节 病毒（噬菌体）克隆载体,病毒基本结构：DNA（或RNA）+外壳蛋白 噬菌体:感染细菌的病毒 分类（根据病毒与宿主的关系）温和性病毒：溶原性增殖构建病毒载体 烈性病毒：溶菌性增殖改造后,噬菌体的电子显微镜照片,一、噬菌体克隆载体,DNA+外壳蛋白 1、DNA(48.5kb)噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点),（一）噬菌体性质,在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)在两端各有12个碱基组成的5单链互补粘性末端(Cohesive end)；进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)。（DNA连接酶）,2、噬菌体基因组有基因61个以上,J与N、P

2、与Q之间为非必需序列,迄今已经定位的噬菌体基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）；另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。,3、限制性核酸内切酶位点:56种4、噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径宿主合成int基因产物-DNA整合到染色体DNA上 某种胁迫条件下合成six基因产物-DNA脱离细菌染色体溶菌,（二）构建依据 1、噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 野生型DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%

3、105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需）3、在DNA上有多种限制性内切酶位点,（三）构建的基本策略与技术路线 策略:切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶位点插入选择性标记基因建立体外包装系统,技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES 为例，EcoRI（48.5kb）DNA E co R I 6个片段,B片段是噬菌体生长非必需的；C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；E片段去掉min5序列（2.6kb）。两端EcoR I别点经点突变或甲基化处理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力：替换B：最大：51

4、-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5）,2、在DNA的非必需区内插入选择标记基因（1）自然筛选（51kb或36.4kb不能包装）（2）插入选择标记基因 取代red和gam基因野生型噬菌体(Spi+表型)在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长（red、gam基因）外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：Lac Z基因,3、建立重组DNA分子体外包装系统体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能

5、转导受体细胞。野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。D-（D基因缺失噬菌体）受体细胞积累除D蛋白以外所有蛋白质E-（E基因缺失噬菌体）受体细胞积累除E蛋白以外所有蛋白质混合 D、E互补 包装DNA分子 噬菌体 如:菌株BHB2688(E-)+BHB2690(D-),（四）噬菌体克隆载体的应用 1、建立c DNA基因文库 转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。效率高。转染(transfection)指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。2、克隆外源目的基因,（五）重组DNA分子的体外包装（自学）,1、溶原菌BHB2688(E-)和B

6、HB2690(D-)的检验2、制备包装物3、体外包装,（一）构建策略 由质粒和含cos位点的DNA片段组装成的载体，即cosmid克隆载体,又叫粘粒;或：cosmid克隆载体是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。,二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体）,（二）cosmid的特征 1、环形双链DNA分子,36.4kb,一般10kb 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3、含有一个cos位点 A蛋白 cos末端体外包装成为噬菌体，但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体,4、cosmid较小，可承载更大的外源D

7、NA 若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。,（三）柯斯克隆(Cosmid cloning),(1)定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做柯斯克隆。这个定义的三个要点是：a.柯斯质粒作载体；b.大肠杆菌为寄主;c.克隆大片段的真核基因组DNA。,（2）理论依据,a.在phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点)b.phage的多连体分子是由cos连接而成的。cos cos cos

8、 cos cos cosc.末端酶(treminase)或叫Ter体系即phage具有一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system).A蛋白*此系统能识别两个相距适宜的(36.451kb)cos位点，并切割之。*根据上述分析可知phage DNA包装的两个必要条件是：cos位点、Ter体系（A蛋白）,（3）柯斯质粒包装条件,由于只有在被作用的DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在36.451kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重

9、组成具有两个cos位点而且相距达36.451kb之间时，才能被包装。,利用Cos质粒进行克隆,（四）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的噬菌体性质转导受体细胞（下图）,三、M13噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体）,含复制起始位点及可插入外源DNA的位点,（一）M13 DNA 环状单链DNA分子（“+”链DNA）大小：6.4kb 结构：10个区 基因间隔区（IS区）,（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖 M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌 合成“-”链产生双链M13 DNA（复制型DNA或RF-DNA）按环状双链DNA

10、方式复制，同时以“+”链DNA为模板转译包装蛋白 RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链 结果只能以“-”链为模板合成“+”链“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体 挤出受体细胞 受体细胞不被溶菌。,M13 DNA复制特征：以双链DNA为中间媒介 培养物高速离心上清中含噬菌体颗粒“+”链DNA 沉淀菌体破碎后，可提取RF-DNA,（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适 RF-DNA上有10个BsuI位点部分酶切获得全长线形RF-DNA,与含LacZ标记的Hind酶切片段进行平末端连

11、接M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在Lac Z区插入连杆 构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。,（四）M13克隆载体的优点与应用 优点：1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞 3、单链DNA不受包装限制，可包装M13 DNA分子6倍的DNA分子 4、可产生大量纯化的含外源DNA插入的单链DNA分子主要用途：克隆、分离单链外源DNA片段 获得的“+”链可直接用于DNA测序,MCS连杆,历史岳麓版第13课交通与通讯的变化资料,精品课件欢迎使用,自读教材填要点,一、铁路

12、，更多的铁路 1地位 铁路是 建设的重点，便于国计民生，成为国民经济发展的动脉。2出现 1881年，中国自建的第一条铁路唐山 至胥各庄铁路建成通车。1888年，宫廷专用铁路落成。,交通运输,开平,3发展(1)原因：甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的。修路成为中国人 的强烈愿望。(2)成果：1909年 建成通车；民国以后，各条商路修筑权收归国有。4制约因素 政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入正轨。,修筑权,救亡图存,京张铁路,二、水运与航空 1水运(1)1872年,正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是在列强排挤中艰

13、难求生。2航空(1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始研制。(2)发展：1918年，北洋政府在交通部下设“”；此后十年间，航空事业获得较快发展。,轮船招商局,水上飞机,筹办航空事宜,处,三、从驿传到邮政 1邮政(1)初办邮政：1896年成立“大清邮政局”，此后又设，邮传正式脱离海关。(2)进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；1920年，中国首次参加。,邮传部,万国邮联大会,2电讯(1)开端：1877年，福建巡抚在 架设第一条电报线，成为中国自办电报的开端。(2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变化。3交通通讯变化的影响(1)新式交通

14、促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和，转变了人们的思想观念。(2)交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便捷。(3)促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活。,台湾,出行,方式,多姿多彩,合作探究提认知,电视剧闯关东讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。,依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。提示：特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车，近代的小火轮、火车同时使用)。原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工

15、业的兴起与发展；政府及各阶层人士的提倡与推动。,串点成面握全局,一、近代交通业发展的原因、特点及影响 1原因(1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促进中国社会发展。(2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。(3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供了物质条件。,2特点(1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和航空都获得了一定程度的发展。(2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。(3)地域之间的发展不平衡。3影响(1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与

16、世界各地的联系，丰富了人们的生活。(2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。,1李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立之势”。这说明该企业的创办()A打破了外商对中国航运业的垄断B阻止了外国对中国的经济侵略C标志着中国近代化的起步D使李鸿章转变为民族资本家,解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D三项表述都有错误。答案：A,二、近代以来交通、通讯工具

17、的进步对人们社会生活的影响(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。(2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社会生活。,2清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写()A电话 B汽车C电报 D火车解析：从“万钧柁”“动如绕指柔”可推断为火车。答案：D,典题例析,例1上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种交通工具前往参观。然而在19世纪七十年代，江苏沿江居民到上海，最有可能乘坐的交通工

18、具是()A江南制造总局的汽车 B洋人发明的火车 C轮船招商局的轮船 D福州船政局的军舰,解析由材料信息“19世纪七十年代，由江苏沿江居民到上海”可判断最有可能是轮船招商局的轮船。答案C,题组冲关,1中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是()A公路运输 B铁路运输C轮船运输 D航空运输解析：根据所学1872年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商办的第一个企业。具有打破外轮垄断中国航运业的积极意义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选C项。答案：C,2.右图是1909年民呼日报上登载的一幅漫画，其要表达的主题是()A帝国主义掠夺中国铁路权益B

19、西方国家学习中国文化C西方列强掀起瓜分中国狂潮D西方八国组成联军侵略中国,解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，20世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路权益。B项说法错误，C项不能反映漫画的主题，D项时间上不一致。答案：A,典题例析,例2(2010福建高考)上海是近代中国茶叶的一个外销中心。1884年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是()A电报业 B大众报业 C铁路交通业 D轮船航运业 解析材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。答案A,题组冲关,3假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信息，可采用的最快捷的方式是()A乘坐飞机赴各地了解 B通过无线电报输送讯息C通过互联网 D乘坐火车赴各地了解解析：本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信息“20世纪初”“最快捷的方式”，因此应选B，火车速度远不及电报快。20世纪30年代民航飞机才在中国出现，互联网出现在20世纪90年代。答案：B,4下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是()A信息传递快捷简便B改变着人们的思想观念C阻碍了人们的感情交流D影响着人们的社会生活解析：新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。答案：C,