细菌和噬菌体的重组和连锁---Recombination-and-Linkage-of-Bacterium-and-Phage课件.pptx

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1、第一节细菌的遗传分析第二节噬菌体的遗传分析,细菌和噬菌体的重组和连锁Recombination and Linkage of Bacterium and Phage,一 细菌概述,(一)细菌的细胞：真核生物（eukaryotes)细胞有细胞核，进行减数分裂和有丝分裂，细菌是原核生物（prokaryotes)，没有细胞核，不进行减数分裂和有丝分裂。而是简单地复制和一分为二。(二)细菌的染色体：细菌为单倍体，其染色体为环形双链DNA分子，不形成核小体结构。,第一节 细菌的遗传分析,（一）大肠杆菌的突变型,1.合成代谢功能突变型（anabolic functional mutant):营养缺陷型（a

2、uxotroph)野生型（wild type)缺陷型（deficient)原养型（prototroph)Met-甲硫氨基酸突变型 Met+Thi-硫胺突变型 Thi+Pur-嘌呤突变型 Pur+2.分解代谢功能突变型（catabolic functional mutant)lac-乳糖突变型，野生型为lac+3.抗性突变型（resistance mutant)：Strr,Strs 分别表示对链霉素有抗性和敏感T1r,T1s分别表示对T1噬菌体有抗性和敏感,二 大肠杆菌的突变型和筛选,（二）突变型的筛选,1.根据菌落特点筛选：如Lac-突变菌株在伊红-美蓝培养基（EMB）上形成白色或粉红色菌落，

3、而lac+菌落为有金属光泽的紫色菌落。2.抗性突变型的筛选：将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上，能形成菌落的就是抗性突变菌株。3.营养缺陷型的筛选：用印迹法(replica-plated method)把在完全培养基上生长的菌落影印到基本培养基上，鉴别出不能生长的克隆。再把它们转移到含有单一营养物质的培养基上，判定该突变型需要哪一种营养物质。,三 细菌的杂交和性别,细菌之间遗传物质的转移主要有四种方式：转化:通过外源DNA进行的细菌遗传物质的转移 接合：由供体菌和受体菌之间的直接接触而导致的遗 传物质的单向转移。性导：是接合的一种，F因子所携带的细菌基因通过接合而导入受体细菌。转导：

4、由噬菌体所介导的DNA从供体菌到受体菌的转移。,(一)细菌的杂交,菌株A:met-bio-thr+leu+thi（+需甲硫氨酸和生物素）菌株B:met+bio+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,出现若干原养型菌落，频率为10-7，说明菌株A和B可以杂交，交换遗传物质，出现基因重组。,(二)细菌的性别,菌株A:met-thr+leu+thi（需甲硫氨酸）菌株B:met+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）,说明菌株A和B在杂交中的作用不同，A为遗传物质的供体(donor)，相当于雄性；而B为受体(recipient)，相当于雌性。,含有链霉素的基本培养基,四 F因

5、子,后来发现，供体和受体的性别差异，是由F因子引起的：供体细菌细胞质中具有F因子（F+)，受体细菌则没有F因子(F-)。F+细菌表面有性伞毛(sex pili)，即F纤毛。,(一)F因子的结构,F因子（F-factor)是一种质粒，又叫致育因子(fertility factor)，它由3个区域组成：原点(origin)：转移的起点 配对区域(pairing region)：与整合有关 致育基因(fertility gene)：使细菌具有感染力，其中有编码性纤毛的基因。,(二)F-细菌与F+细菌的结合和基因转移,F+细胞与F-细胞接触并结合，形成细胞质桥(cytoplasm bridge)，即结

6、合管(conjugation tube).F因子进行滚环复制，通过结合管转移到F-细胞。F-细菌转变成F+细菌。,(三)F因子的整合和环出,F因子和细菌染色体都是环形DNA分子，F因子的配对区域中有一些 可以与细菌染色体的多处的核苷酸序列配对的序列，称为插入序列（insertion sequence,IS)，通过IS的配对和交换，F因子可以整合到细菌染色体上，成为细菌染色体的一部分。象F因子这样即可作为一个复制子独立存在，又可以整合到细菌染色体上，作为细菌复制子的一部分的质粒或遗传因子称为附加体(episome),五 低频重组与高频重组,（一）低频重组(low frequency recomb

7、ination，Lfr)：F+与F-之间的杂交只有F因子的转移，因此尽管F因子的转移频率很高，但是供受体细菌染色体的重组频率却很低，约为10-6，因此F+品系称为低频重组品系(菌株)。（二）高频重组(High frequency recombination，Hfr)：如果F因子整合到细菌染色体上，这种染色体上带有一个整合的F因子的品系，与F-细胞结合后可将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同的遗传标记时，可以观察到它们之间发生重组，重组频率可达到10-2以上，称为高频重组品系（菌株）。但是却很少使F-细菌转变成F+细菌。这个问题一度使遗传学家迷惑不解。,六 中

8、断杂交技术与作图,Wollman和Jacob想知道细菌杂交时，F+如何把基因转移给F-细菌。于1954年进行了以下杂交实验：Hfr F-Hfr:thr+leu+azir tonr lac+gal+strsF-:thr-leu-azis tons lac-gal-strr 混合培养,细菌开始杂交每隔一定时间取样，用搅拌器搅拌断开结合管，使配对的细菌分开，中断杂交，稀释菌液，并影印到各种选择性培养基（selective media)上，测定何时出现重组子。,链霉素抗性半乳糖能否利用乳糖能否利用Tl 噬菌体抗性叠氮化钠抗性亮氨酸合成能力苏氨酸合成能力,时间（分钟）转移的基因9-9 azir 11 a

9、zir tonr 18 azir tonr lac+24 azir tonr lac+gal+1.T=0：杂交开始；2.T=8分钟内，无重组菌落出现；3.T=9分钟，出现少量叠氮化钠抗性菌落，但对T1噬菌体还是敏感的。说明azi r 基因已经进入F-细菌，而tonr 基因尚未进入。4.T=11分钟时，开始出现对T1噬菌体有抗性的菌落（tonr）；5.T=18分钟时，出现能利用乳糖的菌落(lac+)；6.T=24分钟时，出现能利用半乳糖的菌落(gal+)。,(一)中断杂交实验结果,(二)中断杂交技术作图,他们发现不仅Hfr细菌的基因重组进入F-有一定的时间顺序，而且越早进入的基因，它所达到的频率

10、也越高。他们认识到，根据供体基因进入受体细胞的时间顺序可以绘制连锁图，这就是中断杂交技术（interrupted mating technique)。根据中断杂交绘制的基因连锁图，基因的距离的单位是分钟而不是厘摩。因为基因在染色体上呈直线排列，Hfr细菌的染色体从原点(Origin,O)开始，以线性方式进入F-细菌。基因离原点越近，进入F-越早，越远则越迟。而每一次较远基因的转移，都意味着较近基因也要一同转移，因此，越早进入的基因，离原点越近，所能达到的重组频率也越高；越晚进入的基因，离原点越远，所能达到的重组频率也越低。,(三)F因子最后转移,如果让Hfr F-杂交一直进行到2小时再中断，就

11、会发现某些F-受体转变为Hfr,也就是说F因子最后也转移到受体，并使它成为Hfr供体，但是频率很低，说明F因子离原点最远。,F因子的插入使F+细菌变成Hfr菌株，而Hfr菌株的染色体上的F因子的转移造成了高频重组。由于F因子离原点最远，转移频率很低，所以很少使F-变成Hfr或F+。,(四)大肠杆菌染色体是环形的,用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验，分别作成连锁图，发现基因转移的顺序、起点和转移方向却各不相同。据此可以推断大肠杆菌的染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不同。,Hfr H o thr azi lac tsx gal trp mal xyl metB thi

12、 F C o tsx lac azi thr thi metB xyl mal trp gal F J4 o thi metB xyl mal trp gal tsx lac azi thr F P72 o metB thi thr azi lac tsx gal trp mal xyl F,C P72 H J4,七 细菌的交换和重组,细菌的交换与真核生物不同，不是在两套基因组之间进行，而是在一套完整的基因组（F-内基因子，endogenote)和一个不完整的基因组（供体外基因子，exogenote)之间进行的，这样的细胞称为部分二倍体(partial diploid)或叫部分合子(meroz

13、ygote)。这是因为细菌结合管常会自发断裂，结合的过程往往在染色体尚未完全转移时就已经终止，进入F-的Hfr染色体也随之断裂，一般很少有整条Hfr染色体转入F-细胞。,（一）细菌的交换和重组过程,（二）细菌的交换和重组的特点,1.F-受体很少得到完整的F因子，因此大多数重组子仍为F-。只有整条Hfr染色体都转移时，F-才能得到完整的F因子,变成F+(Hfr)。2.只有偶数次交换才能保证细菌染色体的完整性，产生平衡的有活性的重组子；如果内外基因子之间发生单交换，则环状染色体被破坏，产生不平衡的部分二倍体线性染色体，不能复制，细胞不能繁殖；3.重组子只有一种类型，相反的重组子(reciproca

14、l recombinant)不会出现。所以细菌的交换不是一个交互过程，而是单向的。,八 重组作图,当基因距离较近时，转移时间间隔在两分钟之内，则用中断杂交作图就不可靠，而必须用传统的重组作图(recombination mapping)与中断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，如果进行以下杂交：,(一)重组子的产生,(二)重组频率的计算,用重组频率（RF）所测得的基因距离与用中断杂交技术以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cM,(三)大肠杆菌的遗传图谱,根据中断杂交实验和基因重组

15、实验，以及其他基因定位技术的结果，已经绘制出大肠杆菌的环形遗传学图，即基因连锁图，图距单位为分钟，以thr座位为起点（0分钟），总长度为100分钟。图中标出了常用的52个基因座位。,九 F因子和性导,1959年，Adel berg发现了一种新的F因子，并称之为F因子(F-primer factor),这是带有一小段细菌染色体基因的F因子。它能使F-变成F菌株，也能转移细菌基因，形成部分二倍体，但是频率较Hfr为低。利用F因子形成的部分二倍体，将供体细胞基因导入受体的过程，叫做性导(sex-duction or F-duction)。,(一)F-,F+,Hfr,F细菌的相互转化,(二)三种致育因

16、子的相互关系,三种致育因子F,F，Hfr的关系是：1.有F因子的细菌为F+，没有F因子的为F-，具有致育因子（F,F或Hfr）的菌株就是雄性菌株(male strains)。2.F因子可以整合到细菌染色体上，形成Hfr染色体。不同的Hfr菌株F因子的整合位点不同。3.F因子又可以从Hfr染色体上剪切下来，产生F因子。如果剪切不准确而带有一段细菌染色体，则称为F因子。4.F因子很容易转移到F-细胞中，F+F-F+，但是供体染色体的转移频率则很低,重组频率很低。5.Hfr能以高频率把细菌染色体基因转移到F-细菌中，却极少使F-变为F+（因为F因子位于Hfr染色体的最末端）；6.F因子的性质介于F+

17、和Hfr之间，即可转移自身，又可以转移细菌基因。但频率较低。,一 病毒概述,病毒无细胞结构，仅由蛋白质和核酸构成,可以分为:动物病毒植物病毒细菌病毒（噬菌体,bacteriophage,phage）,第二节 噬菌体的遗传分析,二 噬菌体的繁殖和感染周期,（一）烈性噬菌体:如T噬菌体,吸附,细菌裂解,释放出子代噬菌体颗粒,细菌染色体降解,噬菌体DNA和蛋白质外壳包装成子代噬菌体颗粒,(二)温和噬菌体,吸附,溶菌周期,-,uv诱导,细菌裂解,溶源周期,如噬菌体:,原噬菌体,三 噬菌体的突变型,（一）条件致死突变型1.温度敏感突变2.抑制因子敏感突变（二）宿主范围突变型 E.coli B E.col

18、i B/2 E.coli B+E.coli B/2 h+-半透明噬菌斑h-+透明噬菌斑（三）噬菌斑形态突变型1.r+小噬菌斑,边缘模糊:2个以上噬菌体同时侵袭时,出现溶菌阻碍现象(lysis inhibition).2.r-大噬菌斑,边缘清晰:快速溶菌(rapid lysis),无溶菌阻碍现象(lysis inhibition),四 噬菌体的基因重组,用T2噬菌体h-r+和h+r-混合感染E.coli B,再用释放出来的子代噬菌体感染E.coli B+E.coli B/2,出现四种噬菌斑:透明小噬菌斑(h-r+)半透明大噬菌斑(h+r-)透明大噬菌斑(h-r-)半透明小噬菌斑(h+r+),T2

19、噬菌体的四种噬菌斑,五 转导与作图,转导(transduction):以噬菌体为媒介,将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌.供体A 受体B,噬菌体,(一)普遍性转导,普遍性转导(generalized transduction):噬菌体携带供体染色体片段是完全随机的,供体染色体中所有基因具有同等机会被转导入受体,而且各个标记基因被转移的频率大致相等.这是因为噬菌体将供体染色体降解，在合成自身DNA和包装时，偶尔会将细菌染色体片段包装进入子代噬菌体颗粒，并带入受体菌。,如用P22噬菌体转导沙门氏菌:供体A:trp+phe+tyr+受体B:trp-phe-tyr-可出现大致相等的重组

20、子:trp+phe-tyr-trp-phe+tyr-trp-phe-tyr+普遍性转导的频率较低,约为10-5,两个基因同时转导的频率则更低,仅有10-5 10-5=10-10.如果两个基因同时转导的频率则较高,则说明它们相互连锁,成为共转导(cotransduction).共转导的频率越高,则基因连锁越紧密.反之则基因距离越远.据此可用于细菌染色体的基因作图.,(二)局限性转导(restricted transduction),又叫特异性转导(specialized transduction),这类噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因.如噬菌体是一种附加体(episome),即可作为一个

21、复制因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点attB位点,而形成原噬菌体。attB位点一边是gal基因，另一边是bio。在紫外线诱导下，原噬菌体从细菌染色体上离开时，偶尔带有宿主细菌基因，包装形成局限性转导的噬菌体颗粒，可将供体基因转移至受体细菌，但仅限于 靠近attB位点附近的基因，如噬菌体专门转导gal和bio基因。,局限性转导的特点,1.受包装容量限制，局限性转导形成的噬菌体颗粒往往是缺失体(defective)，用 dgal或 dbio表示。由于缺失一段自身DNA，不能产生成熟的颗粒，因此局限性转导的频率很低，只有10-6，所以又称为低频转导（low frequency tra

22、nsduction，LFT）。2.供体基因不是置换受体基因，而是插入attB位点，因此使宿主体内带有两个拷贝的转导基因。例如用 dgal+转导受体gal-后，宿主体内将既有gal+又有gal-基因，由于gal+对gal-为显性，因此宿主能够利用半乳糖。,本章要点,细菌中遗传物质的交换有三种主要的机制：转化、接合和转导。接合需要两个细菌细胞间的物理接触，F+细胞能将F因子转移给不具F因子的F-细胞，使之成为F+细胞。如果F因子通过一个单交换整合到染色体上，它就成为HFr菌株，能将细菌染色体转移到F-细胞。有时F因子从HFr染色体上分离出来时并不是很精确的，使分离出来的F因子带有一小段宿主染色体，

23、这种含有细菌基因组的F因子就叫做F，因子。在接合过程中通过F，因子将某个特异的细菌基因传递给受体的过程称为性导。利用接合可制作远距离基因的遗传图。在转化中，单链DNA从周围环境中通过细胞膜进入受体细胞，并且通过重组整合到受体细胞的DNA上。转化对用于遗传作图是有限的，但它对于将外源DNA整合到细菌细胞中特别有用，是现代基因工程中常用的技术。转导可用于紧密连锁基因的精确定位。因此，两个紧密连锁的遗传标记通过它们的共转导频率能进行精确的定位。转导分为普遍性转导和特异性转导两种。,本章思考题,1为什么说细菌和病毒是遗传学研究的好材料？2大肠杆菌的遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂过程的生物有什么不

24、同？3解释下列名词：（1）F-菌株，F+菌株，Hfr菌株；（2）F因子，F，因子，质粒，附加体；（3）溶源性细菌，非溶源性细菌；（4）烈性噬菌体，温和噬菌体，原噬菌体；（5）部分合子（部分二倍体）；4部分合子在细菌的遗传分析中有什么用处？5什么叫转导、普遍性转导、特异性转导（局限性转导）？,6转导和性转导有何不同？7一个基因型为a+b+c+d+e+并对金霉素敏感的E.coliHfr菌株与基因型为a-b-c-d e-并对金霉素耐性的F-菌株接合，30分钟后，用金霉素处理，然后从成活受体中选出e+的原养型，发现它们的其它野生型（+）基因频率如下：a+70%，b+-，c+85%，d+10%。问a b

25、 c d四个基因与供体染色体起点（最先进入F-受体之点）相对位置如何？8.为了能在接合后检出重组子，必须要有一个可供选择用的供体标记基因，栾可以认出重组子。另一方面，在选择重组子的时候，为了不选择供体细胞本身，必须防止供体菌株的继续存在，换句话说，供体菌株也应带有一个特殊的标记，能使它自己不被选择。例如供体菌株是金霉素敏感的，这样当结合体（conjugants）在含有金霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。现在要问：如果一个Hfr菌株是金霉素敏感的，你认为这个基因应位于染色体的那一端为好，是在起始端还是末端？,9.有一个环境能使T偶数噬菌体（T-even Phages）附到寄主细胞上，这个

26、环境条件就是色氨酸的存在。这种噬菌体称为色氨酸需要型（C）。然而某些噬菌体突变成色氨酸非依赖型（C+）。有趣的是，当用C和C+噬菌体感染细菌时，将近一半的色氨酸非依赖型子代在进一步的实验中表现为基因型C。你如何解释这个发现？10.基因型ACNRX菌株，作为外源DNA用来转化基因型acnrx的菌株得到下列类型AcnRx，acNrXaCn Rx，AcnrX。aCnrx 请问被转化的基因顺序是什么？11用一野生型菌株抽提出来的DNA转化一个不能合成丙氨酸（ala）、脯氨酸(pro)和精氨酸(arg)的突变型菌株，产生不同转化类型的菌落，其数如下：8400 ala+pro+arg+840 ala+pr

27、o-arg-2100 ala+pro-arg+1400 ala+pro+arg-420 ala-pro+arg+840 ala-pro+arg-840 ala-pro-arg+问：（1）这些基因间的图距为多少？（2）这些基因的顺序如何？,12.Doerman用T4病毒的两个品系感染E.coli。一个品系是小噬菌斑（m）快速溶菌（r）和浑浊噬菌斑（tr）突变型。另一个品系对这三标记都有是野生型（+）。把这种感染的溶菌产物涂平板，并分类如下：基因型 噬菌斑数 m r tu 3467+3279 mr+853 m+tu 162 m+520+rtu 474+r+172+tu 965 10342(1)决定

28、m-r，r-tu和m-tu的连锁距离？(2)你认为这三个基因的连锁序列怎样？(3)在这个杂交中，并发系数是多少？它意味着什么？,13利用中断杂交技术，检查了5个Hfr菌株（1，2，3，4，5），想知道这几个菌株把若干个不同基因（F，G，O，P，Q，S，W，X，Y）转移到一个F-菌株的顺序。结果发现，各个Hfr菌株都以自己特有的顺序转移，如下所示：（各品系只记下最初转移进去的6个基因）Hfr菌株 1 2 3 4 5转移顺序 第一 Q Y R O Q 第二 S G S P W 第三 R F Q R X 第四 P O W S Y 第五 O P X Q G 第六 F R Y W F问：（1）这些Hfr

29、菌株的原始菌株的基因顺序如何？（2）为了得到一个最高比例的Hfr重组子，在接合后应该在受体中选择哪个供体标记基因？提示：Hfr品系是环状DNA。,14为了检出噬菌体的4个基因（co1,mi,c和s）间的连锁关系，Kaiser做了一个杂交试验，下面是杂交结果的一部分数据：亲本 子代(a)co1+mi 5162 co1+6510+mi,311+,341 co1mi(b)mi+s 502 mi+,647+s,65+,56 mi s(c)c+s 566 c+,808+s,19+,20 c s(d)c+mi 1213 c+,1205+mi,84+,75 c mi 问：（1）每个杂交组合的重组频率是多少？

30、（2）画出co1,mi,c和s四个基因的连锁图。,15用P1进行普遍性转导，供体菌是pur+nad+pdx-,，受体菌是pur-nad-pdx+-。转导后选择具有pur+的转导子，然后在100个pur+转导子中检定其它供菌基因有否也转导过来。所得结果如下表:基因型 菌落型 nad+pdx+1 nad+pdx-24 nad-pdx+50 nad-pdx-25 合计 100 问：pur和nad的共转导(cotransduction)频率是多少？pur和-pdx的共转频率是多少？哪个非选择性座位最靠近pur？nad和pdx在pur的同一边，还是它的两侧？根据你得出的基因顺序，解释实验中得到的基因型的相对比例。,