药品无菌检查及相关知识培训教材课件.ppt

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1、药品无菌检查及相关知识,吉林省药品检验所微生物室,主要内容,1、药品无菌检查法基础2、2015年版药典无菌检查法的变动3、洁净实验室微生物的监测和控制4、菌种的管理5、二级生物安全实验室,药品无菌检查法,定义及特点培养基、冲洗液方法学验证供试品的无菌检查无菌检查的要点,药品无菌检查法,无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。,药品无菌检查法,无菌制剂比非无

2、菌制剂存在更高的风险一系列的药品不良事件2006年的“欣弗事件”-安徽华源生产的“克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液”引起了11人死亡，93人感染，企业倒闭，总经理自杀。未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果，经中检所检验，发现无菌不合格。2012年10月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡39人。这些事故促使无菌制剂GMP监管的进步，同时也对无菌检验提出更高更严的要求。,药品无菌检查法,特点无菌检验结论为一次性，药典规定为不得复试，为什么不得复试，菌落的分布具有不均匀性，检验过程是破坏性的，不具有重

3、复性。-对操作过程的要求非常高。过程的控制-1、环境控制；2、操作影响，人员、物流是否引入外源性污染？,无菌性检查,灵敏度检查,SOP操作,有效的结果,有效的方法,环境保证,培养基保证,方法学验证,过程控制,结果判断,可靠的结论,药品无菌检查法,培养基配制后采用验证合格的灭菌程序灭菌。什么是验证合格的？保存条件：2-25、避光，非密闭容器在3周内使用，密闭容器一般在1年内使用。流乙醇酸盐流体：供试品接种前，培养基氧化层不超过深度的1/5，否则100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），只能加热一次，培养结束后氧化层不超过1/2,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查

4、及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,培养基适用性检查无菌性每批次培养基取不少于5瓶（支），培养14天，应无菌生长。灵敏度 6种菌（100cfu）金、铜绿、生孢-流乙醇酸盐流体 7支，12ml/支，每种菌接种2支，阴性一支，枯草、白念、黑曲-胰酪大豆胨液体 7支，每种菌接种2支，9ml/支，一支阴性 流乙醇酸盐流体培养3天，胰酪大豆胨液体 5天，空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基的灵敏度符合规定,药品无菌检查及相关知识培训教材PP

5、T课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,冲洗液0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液可选用其他经验证过的适宜的溶液,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,方法适用性试验证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。菌种：金葡、大肠、枯草、生孢、白念、黑曲方法：1、薄膜过滤 2、直接接种,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品

6、无菌检查法,薄膜过滤法试验组：取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。对照组：另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，培养时间不得超过5天。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,直接接种法 取流乙醇酸盐流体培养基（不少于15ml）6管，分别加入金葡、大肠、生孢各2管，其中一管接入供试品，另一管作为对照，TSB（不少

7、于10ml）6管，分别加入枯草、白念、黑曲各2管，其中一管加入供试品，另一管作为对照，培养时间不得超过5天。结果判断：与对照管比较，试验组的试验菌生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计；如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长-供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用-增加冲洗量、培养基用量、中和剂或灭活剂、更换滤膜品种，重新进行方法适用性试验。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,供试品的无菌检查 检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量 出厂产品按表

8、1，上市产品监督检验按表2 最少检验数量不包括阳性对照用的。检验量：按表3，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允 许，应将所有容器内的全部内容物过滤。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,1、薄膜过滤法 封

9、闭式薄膜过滤器只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤抗生素样品选用低吸附的滤膜水溶性供试品过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品的滤膜和滤器在使用前应充分干燥冲洗量一次一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以免膜上的微生物受损。总冲洗量特别大时应尽量减小流速。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,水溶性的液体-直接过滤或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤，如供试品有抑菌作用，须冲洗一般不少于三次。水溶性的固体-溶取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签复溶。非水溶性供试品-直

10、接过滤，或乳化后（加吐温80等）立即过滤，用含0.1-1%吐温80的冲洗液冲洗，培养基中可加入吐温80可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油性供试品-溶解于适量无菌十四烷酸异丙酯中，过滤，加热仍然没法过滤的，萃取，静置，取水层过滤无菌气雾剂-在-20冷冻1小时，取出在容器上钻一小孔释放抛射剂后再无菌开启容器，转移至无菌容器中。装有药物的注射器供试品注意应采用适宜的方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查带有导管的医疗器具（输血、输液袋等）-每个最小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内壁，过滤冲洗液。同时注意应采用直接接种法对配带的无菌针头做无菌检查,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精

11、编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,2、直接接种法培养基的用量符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，流乙醇酸盐每管装量不少于15ml，TSB不少于10ml适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量，等量接种至各管培养基中固体供试品 取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量等量接种至各管培养基中。非水溶性供试品 加入适量的乳化剂及稀释剂使其乳化

12、再接种，或直接接种至含乳化剂的培养基中敷料供试品 以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg或1cm*3cm的供试品，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。肠线、缝合线等供试品 取最小包装，无菌拆开包装，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。灭菌医用器具供试品 必要时将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。放射性药品 取供试品1支，等量接种于装量为7.5ml的流乙醇酸盐流体培养基和TSB中。每管接种量为0.2ml。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,阳性对照 无抑

13、菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的-金葡 抗革兰氏阴性菌为主的-大肠 抗厌氧菌的-生孢梭 抗真菌的-白念 阳性对照72小时内生长良好 阴性对照 相应的溶剂、稀释液、冲洗液同法操作，不得有菌生长,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,培养及观察液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变化？培养14天，逐日观察并记录，注意和阳性、阴性对比，培养14天后依然无法从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液转种至同种新鲜培养基，培养3天，观察是否再次出现浑浊。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相

14、关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,若明显浑浊-怎么办？1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存；3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,结果判断阳性对照生长良好，阴性不得有菌，否则试验无效若供试品澄清，或虽然浑浊但经确证无菌生长，判供试品符

15、合规定若任何一管浑浊并确证有菌生长，判不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，符合下面至少一个条件：1、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求2、回顾试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素3、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。若确认无效，应重试。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查法,要点一个标准的SOP，物料进场，外围消毒剂消毒表面，拆除外包装，洁净传递，风淋、紫外照射，过氧化氢灭菌等，由低级别向高级别递进，最后到达A级核

16、心区人员进场，合理的更衣程序，A/B级：应用头罩将所有头发以及胡须等相关部位全部遮盖，必要时戴防护目镜。应戴经灭菌且无颗粒物（如滑石粉）散发的橡胶或塑料手套，穿经灭菌或消毒的脚套，裤腿应塞进脚套内，袖口应塞进手套内。工作服应为灭菌的连体工作服，不脱落纤维或微粒，并能滞留身体散发的微粒。无菌操作技术，动作熟练，关键点的控制实验过程的监控：环境菌，表面微生物，手部微生物，对环境菌进行鉴定，建立档案，以便OOS调查，进行溯源。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,主要修订点改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨肉汤培

17、养基（TSB）无菌检查实验条件由“万级下的局部百级”修订为“B+A”三部药典的统一,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,培养基的变化,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,意义1、与国际接轨USPBP2、培养-观察的体系改变，取消严格意义上的以真菌、细菌划分的培养，而以需氧、厌氧的培养体系来划分，是一个更加广泛，更加互补的体系。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PP

18、T课件1【精编】,2015年版药典的变化,培养基的改变导致阳性菌的培养条件改变培养基灵敏度实验：,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,方法适用性实验：,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,菌种的培养条件改变,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,2015年版药典的变化,无菌检查实验条件由“万级下的局部百级”修订为“B+A”和以前的100级、1000

19、0级的区别？需要怎么控制环境？,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,洁净室的定义及分级两版药典对洁净室的要求对比洁净室微生物的监测与控制微生物鉴定隔离器简介消毒剂的选择与使用几种空间灭菌方法,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,洁净室的定义与分级药品洁净实验室是指用于药品无菌或微生物检验用的洁净实验室、隔离系统及其它受控环境。洁净室不是绝对无菌的。概念不等于无菌室（命名需准确）,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无

20、菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,洁净室的分级ISO14644-按悬浮粒子大小划分了洁净室的级别（等级1-9级）ISO14698-洁净室及其相关控制环境,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,各国不同法规对于洁净室污染控制的要求对比美国联邦标准FED-STD-209E：率先建立了由悬浮粒子含量规定空气洁净度的分级标准，以每立方英尺空气所含最大允许微粒的数量确定，分为1、10、100、1000、10000、100000六个级别。国际标准ISO14644-1：空气洁净度分为9个级别，比美国联邦标准

21、多出3个。美国FDA无菌工艺药品CGMP工业指南：以动态期间在物料漏置临近处所测数据为依据，强调了动态概念，对微生物进行了控制，100、1000、10000、100000对应ISO5、6、7、8美国药典1116：根据美国联邦标准改编，M1-M7欧盟GMP：A、B、C、D，静态、动态监测、强调了粒子的在线监测2010年版GMP:等同于欧盟,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考现行“药品生产质量管理规范”分为A、B、C、D 4 个级别。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编

22、】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,初次使用的洁净实验室应进行参数确认，确认参数包括物理参数、空气悬浮粒子和微生物。,物理参数,空气悬浮粒子,微生物,浮游菌,沉降菌,表面微生物,空气过滤器完整性，气流组织、空气流速，换气次数、压差、温度和相对湿度,参数确认,执行标准洁净室施工及验收规范附录D3 高效空气过滤器现场扫描检漏方法粒子计数器法、附录E12 气流的检测、附录E1 风量和风速的检测、附录E2 静压差的检测、附录E5 温湿度的检测,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,2015年版

23、与2010年版的物理指标相比 100级与A级比较，单向流断面风速相差较大，100级洁净区需要增加循环风量才能达到A级，10000级洁净区空调系统需要增加1倍的送风量，才能达到B级,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,洁净室微生物监测和控制 定期清洁、消毒、消毒效果验证包括：非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性的微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测，及关键的检测台面、人员操作服表面及5 指手套等的微生物检测。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课

24、件1【精编】,洁净实验室,悬浮粒子用于空气洁净度分级的空气悬浮粒子尺寸范围在0.1m-1000m的固体和液体粒子。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,方法：GB/T16292-2010医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法采样点数目：最少采样数，两种方法，一、NL最少采样点A洁净室或被控洁净区的面积，单位为平方米（单向流，垂直于气流方向上的横截面积）,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,二|查表,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课

25、件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,采样点位置与分布：离地面0.8m高度的水平面上均匀分布采样点多于5点时，也可在离地面0.8-1.5m高度的区域内分层布置，每层不少于5点静态测试时，采样点布置力求均匀（附录A），动态测试，应根据关键操作区布置。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,采样次数：对任何小洁净室（区）或局部空气净化区域，采样点数目不少于2个，总采样次数不少于5次，每个采样点的采样次数可以多于1次，不同采样点的采样次数可以不同每次采样量：,药品无菌检查及相关知识培

26、训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,计算：（计算详细见GB标准）结果：每个采样点的平均悬浮粒子浓度必须不大于规定的级别界限全部采样点的悬浮粒子浓度平均值均值的95%置信上限必须不大于规定的级别界限，UCL级别界限,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,浮游菌、沉降菌：,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,方法：GB/T16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法 GB/T

27、16293-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法浮游菌最少采样点参照悬浮粒子 GB/T16292-2010采样点的位置参照悬浮粒子 GB/T16292-2010 工作区测点位置离地0.8-1.5m左右（略高于工作面）送风口测点位置离开送风面30cm左右。可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。采样次数每个采样点采样一次,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,最小采样量：,注意事项单向流区域，采样器采样口朝向应正对气流方向；非单向区域，采样口朝上。采样点避开回风口。测试人员站在采样口的下风侧，尽量少走动。为

28、避免培养皿运输或搬动过程的影响，应对培养皿做阴性对照（不暴露采样），应无菌生长。记录测试者名称，日期，测试依据，洁净室的平面位置，测试仪器，方法描述，包括测试环境条件，采样点位置，布置图，测试次数，采样量，测试仪器检定证书，动态测试应记录现场人员数量位置，设备的数量和位置，测试结果。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,结果每点浮游菌平均浓度（个/m3）=菌落数/采样量 结果评定每个测点的浮游菌平均浓度必须低于标准的界限静态测试，某点浮游菌平均浓度超过评定标准，则应重新采样两次，两次结果均合格才能判定为合格。,药品

29、无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,沉降菌 最少采样点参照悬浮粒子GB/T16292-2010 采样点的位置参照悬浮粒子GB/T16292-2010最少培养皿数,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,结果计算平均菌落数=(M1+M2+MN)/NM11号培养皿菌落数N 培养皿总数结果评定同浮游菌,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,表面微生物表面微生物测定是对环境、

30、设备和人员的表面微生物进行监 测，方法包括接触碟法和擦拭法。接触碟法将充满规定的琼脂培养基的接触碟对规则表面或平面进行取样，然后置合适的温度下培养一定时间并计数，每碟取样面积约为25 cm2，微生物计数结果以cfu/碟报告；擦拭法接触碟法的补充，用于不规则表面的微生物监测，特别是设备的不规则表面。擦拭法是采用合适尺寸的无菌模板确定擦拭的面积，取样后，将拭子置合适的缓冲液或培养基中，充分振荡，然后采用适宜的方法计数，每个拭子取样面积为约25 cm2，微生物计数结果以cfu/拭子报告。接触碟法和擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同浮游菌或沉降菌（一般采用TSA，当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影

31、响时，可增加SDA）表面菌测定应在实验结束后进行。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,推荐的药品洁净实验室的监测频次及监测项目,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,如果出现连续超过纠偏限和警戒限、关键区域内发现有污染微生物存在、空气净化系统进行任何重大的维修、消毒规程改变、设备有重大维修或增加、洁净室（区）结构或区域分布有重大变动、引起微生物污染的事故、日常操作记录反映出倾向性的数据时应考虑修改监测频次。,药品无菌检查及相关知识培训教

32、材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,偏差处理 当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时，应当按照偏差处理规程进行报告、记录、调查、处理以及采取纠正措施，并对纠正措施的有效性进行评估。微生物鉴定 建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定1、有助于预期常见菌群。2、有助于评估清洁/消毒方法、消毒剂的有效性。3、有助于污染源的调查，辅助OOS调查。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教

33、材PPT课件1【精编】,洁净实验室,微生物鉴定通则9205“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时达到菌株水平。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,微生物鉴定借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编

34、】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,鉴定程序分离纯化初筛试验表型微生物鉴定基因型微生物鉴定（16SrDNA、18SrDNA、聚合酶链式反应、DNA-DNA杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等）,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,分离纯化纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体平板划线法是最常用的技术,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,初筛试验（革兰氏染色、芽孢染色、镜检观察细胞形态、重要的生化反应）重要的

35、生化筛选试验氧化酶试验：氧化酶阳性：不发酵的革兰氏阴性杆菌、氧化酶阴性：肠道菌过氧化氢酶试验 阳 性：葡萄球菌 阴性：链球菌凝固酶试验 阳 性：致病性 阴性：非致病性,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,表型微生物鉴定培养物（菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素）形态学（细胞形态、大小、形状、鞭毛、内容物、革兰氏染色、芽孢 和抗酸染色、孢子形成模式）生理学（氧气耐受性、pH值范围、最适温度和范围、耐盐性）生化反应（碳源利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式）抑制性（胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性）血清学（凝

36、集反应、荧光抗体）化学分类（脂肪酸构成、微生物霉素、全细胞组分）生态学（微生物来源）,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,基因型微生物鉴定微生物由于特殊环境的影响，表型特征常发生变异，传统形态学鉴定手段难以得到种水平结果，以其核酸序列为鉴定基础，从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系（16SrDNA、18SrDNA、聚合酶链式反应、DNA-DNA杂交、焦磷酸测序、多位点序列分型等）,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品无菌检查

37、及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,伯杰氏系统细菌学手册对细菌的分类是通过遗传物质的分析比较来实现。基因鉴定法不但技术需要保证，还需要昂贵的分析设备和材料，通常在关键微生物调查中使用，如产品不合格调查，若使用，方法必须经过确认鉴定方法的确认包括：准确度、专属性、重现性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室

38、,隔离器 分类：硬仓、软仓结构：1、空气处理系统（高效空气过滤器）2、传递接口及传递门 3、灭菌设备（一般为过氧化氢、过氧乙酸等灭菌）4、配套设备与辅助设备,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,隔离系统的验证1、操作验证2、隔离器完整性验证3、灭菌验证4、灭菌循环验证5、隔离器内部洁净度

39、验证6、仪器仪表验证,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,药品洁净实验室怎样实现微生物的良好控制？处于受控状态？1、硬件设施的满足 洁净室的验收应符合规范，换气次数，送风量、环境温湿度等等2、良好的环境管理，清洁、消毒程序，并严格执行，选择适当的消毒方式，合理的消毒剂，清洁消毒频率。监测到位。3、减少人员干预，人是最大的污染源，规范人员进出洁净区的程序，严格按照A/B洁净区的要求做好人员防护。做好人员培训。4、控制物流的干扰，做好物流的消毒、外表面灭菌工作，减少物流的污染5、应当对监测数据进行分析、回顾，通过收集的

40、数据和趋势分析，总结和评估洁净实验室是否受控。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,消毒剂的选择与使用微生物的抗力从小到大排列一般为：细菌繁殖体真菌繁殖体真菌孢子病毒分枝杆菌细菌芽孢,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,消毒剂选择、使用 将消毒剂种类分为四个作用水平（1）灭菌：可杀灭一切微生物（包括芽孢）达到灭菌保证水平的方法。甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等。（2）高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对芽孢杀灭达到消毒效果的

41、方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体（包括结核分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。（3）中水平消毒法：杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，碘类消毒剂(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。（4）低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体（分枝杆菌除外）和亲脂病毒的化学消毒剂。如单链季铵盐类消毒剂(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂。,药品无菌检

42、查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,消毒剂的配制：1、按供应商的使用说明配制和储存。2、A/B级区域应使用经除菌过滤的消毒剂。3、尽量高级别的水配制，纯化水、灭菌水、注射用水,配好后放置一会。影响消毒剂效力的因素：浓度、接触时间、pH值、温度、微生物的数量和种类,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,消毒剂的选择原理1、根据市售消毒剂的抗菌谱、根

43、据区域等级，A/B级选用杀孢子剂，其他区域可配合使用其他水平的消毒剂，定期使用杀孢子剂。2、根据使用说明，规范使用浓度和作用时间3、根据待消毒表面的材质。如对设备表面的腐蚀程度对操作者的安全性。（残留、腐蚀、粘膜刺激）4、和清洁剂，其他消毒剂的相容性5、选用多种类的消毒剂，交替使用，避免微生物对其产生耐受性。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,几种空间灭菌方法：熏蒸灭菌概念 1980年收录于USP，在一定温度和压力的密闭条件下，化学消毒剂转为气态渗透到生物体内，使生物致死。有助于降低洁净区死角的微生物污染。甲醛：

44、对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂 通常推荐12小时灭菌时间，排气、通风至少24小时，过程漫长，有致癌作用，现在已很少使用臭氧：对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂 无残留，无污染，臭氧对人体有害，为强氧化剂，对多种物品有损坏，橡胶老化、铜片生锈，织物褪色等。过氧化氢：对所有微生物都有杀灭作用。杀孢子剂 2H2O22 H2O+O2过氧化氢灭菌安全，环境友好，不产生有毒有害残留物最终分解产物为H2O和O2，无毒无残留。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,紫外消毒的应用紫外线：空气消毒、物体表面消毒 用UV进行表面消毒

45、时，要求灯管距离污染表面不超过1m，30WUV灯照射时，照射时间不应短于30分钟，灯管周围1.5-2.0m为消毒有效区。应对灯的紫外线照射强度进行监测，当强度低于规定值时，及时更换。方法：生物指示剂/物理学检测生物指示：大肠杆菌，照射剂量应达到20000ws/cm2,枯草杆菌黑色变种芽孢应达到100000ws/cm2。物理学检测方法：灯管的紫外线强度（w/cm2）用中心波长为253.7nm的紫外线强度测定仪（标定有效期内），在灯管垂直位置1m处测定。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,洁净实验室,判定指标（1）电压220V，

46、室温2025，253.7nm紫外线辐射强度（垂直1m处）普通30W直管型紫外线灯70w/cm2；高强度紫外线灯 200w/cm2。（2）表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。应达到100000w.s/cm2。剂量（w.s/cm2）=辐射强度（w/cm2）时间（s）。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。CMCC-中国医学菌种保藏中心 C

47、MCC（F）CMCC（B）,F-真菌；B-细菌ATCC-美国标准菌种收藏中心,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,定义标准菌株 至少定义到属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述，有明确的来源。标准储备菌株 从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。应进行纯度和特性确认。可用于制备每月或每周1 次转种的工作菌株。工作菌株 由标准菌株、标准储备菌株转接后获得的同种菌株。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药

48、品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,申购：菌种管理人员提出购买申请验收：接受菌种时应检查菌种的名称，代号，数量，完整性，记录信息。菌种复活：冷冻菌种的复活，无菌操作打开玻璃管，用相应的液体培养基0.5-1ml溶解冷冻菌种，转移至适宜的培养基中复活。确认：用无菌接种环取复活的培养物，在相应的培养基平板上划线分离培养，观察典型的菌落形态，菌落形态的一致性，挑取单个菌落形态进行革兰氏染色、镜检，观察染色特性及微生物形态学特征，生化反应或用菌种鉴定系统进行进一步

49、鉴定。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,保藏-确保在相应的保藏条件下的菌种不会变异且性能稳定，经济简便。甘油冷冻保藏：液体培养物加入等体积的20%甘油，混匀，分装于1ml的小管，-80-30保存；或菌苔刮取后分散于无菌水中，加入等体积20%甘油的TSB中。再分装。瓷珠保藏法 将培养好的微生物细胞或孢子制成悬浮液，转入装有无菌多孔玻璃珠（或瓷珠）的无菌瓶中，使其吸附于玻璃珠表面，去除多余悬浮液，低温冷冻保存的一种菌种保藏方法。SN/T 2660-2010 食品微生物实验室菌种保藏方法：-70可保存10年斜面低温保

50、藏：把待保藏菌接种在适宜的斜面培养基表面，充分生长后，在4左右冰箱保存。铜绿不能用此法保存。,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,药品无菌检查及相关知识培训教材PPT课件1【精编】,菌种的管理,传代：工作菌株的传代次数不得超过5 代（标准菌株为第0 代）。1 代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。传代时，应对工作菌株的特性和纯度进行确认。使用：使用工作菌种制备菌液，做好记录。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使