酵母基因工程培训课程课件.ppt
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1、第十五章 酵母基因工程,五、酵母菌的表达系统,第十五章 酵母基因工程,三、酵母菌的载体系统,二、酵母菌的宿主系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,六、利用重组酵母生产乙肝疫苗,四、酵母菌的转化系统,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的分类学特征,酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。,一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特
2、征,2、酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的,基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS),酵母菌是最简单的真核模式生物,第十五章 酵母基因工程,二、酵母菌的宿主系统,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,第十五
3、章 酵母基因工程,1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括:,酵母属 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis),毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),汉逊酵母属 如多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha),其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽,但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导
4、致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶,ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平,ose1 提高重组蛋白表达 转录水平,ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基
5、核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统,但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制,呈,超糖基化倾向,因此超糖,基化缺陷株非常重要。,4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,(1)泛素、介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,(2)酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因:,UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素-羧基延
6、伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76(CEP76)对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因:,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,(3)泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中,泛素主要由UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能,UBI 4缺陷型:,正常生长,但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,,因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA 1缺陷型:,UBA1编码泛素激活酶E1,UBA1突变株是致死
7、性的,但其等位,基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介导的蛋白降解,Ubc4-ubc5 双突变型:,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,三、酵母菌的载体系统,酵母菌克隆表达质粒的构建,2,酵母菌中的野生型质粒,1,第十五章 酵母基因工程,1.酵母菌中的野生型质粒,(1)酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,环状质粒,拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列,600 bp,重组,FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性,STB REP的结
8、合位点,接合酵母属中的pSR1和pSB1,以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质,粒类似。,1.酵母菌中的野生型质粒,(2)乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基,的双链线状质粒pGKL1和pGKL1,拷贝数为50-100个,分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因(a b g),同时含有毒素蛋白抗性基因。,2.酵母菌克隆表达质粒的构建,(1)含有ARS的YRp质粒的构建,ARS为酵母菌中的自主复制序列,0.8-1.5kb,染色体上每30-40kb,就有一个ARS元
9、件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个,但培养几代,以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,后,质粒的丢失率高达50%-70%,主要是由于分配不均匀所致。,2.酵母菌克隆表达质粒的构建,(2)含有CEN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中,获得的新载体称为YCp,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性,但拷贝数只有1-5个,(3)含有TEL的YAC质粒的构建,2.酵母菌克隆表达质
10、粒的构建,(4)含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因,,构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定,序列中,这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域,四、酵母菌的转化系统,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,1、酵母菌的转化程序,3、用于转化子筛选的标记基因,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的转化程序,(1)酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法,在Ca2+和PEG的存在下,转化细胞可达原生质体总数的1-2%。,但该程序操作周期长,而且转化效率受到原
11、生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是,一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子,而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%,1、酵母菌的转化程序,(2)碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子(如Li+等)、PEG、热休克,处理后,也可高效吸收质粒DNA,而且具有下列特性:,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA,两者相差80倍,共转化现象极为罕见,1、酵母菌的转化程序,(3)酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA,,但在此过程中应避免使用PEG,它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体
12、细胞的遗传特征及培养条件,适用范围广,而且转化率可高达105/mg DNA。,2、转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链DNA均可转化酵母菌,但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后,能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后,能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在YIp整合型质粒上的外源基因,如果含有受体细胞的染色体,DNA的同源序列,会发生高频同源整合,整合子占转化子总,数的50-80%,3、用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和,显性基因两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和
13、核苷酸生物合成基因,如:,LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但对于多倍体酵母来说,筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,3、用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph 氨基糖苷转移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,五、酵母菌的表达系统,2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,1、酵母菌启动子的可控性,3、酵母菌表
14、达系统的选择,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌启动子的可控性,pho4TS-PHO5启动子:,酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,因此,装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭,23诱导表达,(1)温度控制型启动子,PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活,1、酵母菌启动子的可控性,a a 型启动子:,酿酒酵母有a和a两种单倍体,分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2
15、-102能产生a2变体,它能灭活a1,同时阻遏a型,温度控制型启动子,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,a2,a1,25,35,1、酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,(2)超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显,基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时,GAL4高效表达,GAL1、GAL1、GAL10超高效表达,GAL10,Prom
16、oter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因编码,2、外源基因在酵母菌中表达的限制因素,外源基因稳态mRNA的浓度,外源基因mRNA的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中,高丰度的蛋白质(如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH)中96%,以上的氨基酸是由25个密码子编码的,3、酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟,包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢,(1)酿酒酵母表达系统,酶基因ADH所属的启动子,多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大
17、问题在于其超糖基化能力,往往使得,有些重组蛋白(如人血清白蛋白等)与受体细胞紧密结合,而不能,大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,3、酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体,即便在无选择压力的条件下,也,(2)乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白,性能均优,于酿酒酵母表达系统。,3、酵母菌表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌,能在低廉的甲醇培养基中生,(3)巴斯德毕赤酵母表达系统,长,甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达,因此生长,
18、迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体,所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下,外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,3、酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被,(4)多型汉逊酵母表达系统,克隆,并用于构建克隆表达载体,但与巴斯德毕赤酵母相似,这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是,HARS质粒,能高频自发地整合在
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