降解丙烯酰胺菌的筛选及应用本科毕业论文.doc

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1、 本科生毕业设计(论文)中文题目降解丙烯酰胺菌的筛选及应用 外文题目Screening of acrylamide degradation bacteria and its application 学号0708180076 姓名* 学院生命科学学院 专业生物工程 指导教师* 完成时间2011年5月2号 江西师范大学教务处制摘 要1ABSTRACT21 前言31.1 丙烯酰胺的应用31.2 丙烯酰胺菌的危害31.3 降解丙烯酰胺菌的研究意义42.材料与仪器42.1 菌种来源42.2主要药品和试剂42.3 实验仪器52.4 培养基62.4.1 选择性培养基62.4.2 葡萄糖氧化发酵培养基62.4

2、.3 甲基红试验和V-P试验培养基73. 实验方法及原理73.1降解丙烯酰胺菌筛选流程73.2 菌株的富集73.3 菌株的分离纯化83.4 菌种的生理生化鉴定4-583.4.1 革兰氏染色83.4.2 接触酶试验83.4.3 甲基红试验83.4.4 V-P试验83.4.5葡萄糖氧化发酵实验93.5 重络酸钾法测COD【6-8】93.6 丙烯酰胺降解率的测定93.7 丙烯酰胺含量的测定104. 结果与分析114.1降解丙烯酰胺菌的分离114.2 优势菌的菌体染色及形态鉴定114.2.1 菌体染色114.2.2 生理生化鉴定124.3菌株生长条件优化124.3.1降解时间的影响124.3.2 接种

3、量的影响134.3.3培养温度的影响134.3.4初始pH值的影响144.4污水COD值测定144.4.1菌株对污水COD降解结果154.4.2 菌株对丙烯酰胺除去率结果165.结论16参考文献17致 谢18摘 要微生物降解因其特有的无害化处理将成为解决丙烯酰胺引起环境污染问题的有效手段。采用富集、选择培养分离的方法，从江西昌九农科化工有限公司厌氧池废水中筛选分离得到能够降解丙烯酰胺单体的菌株，对菌株的培养基及生长条件优化，得到一株降解效果较好的菌株,最后对该丙烯酰胺降解菌进行基本的生理生化特性测试，初步鉴定属葡萄球菌属，最适生长温度为33，最适生长pH为7.0左右，最佳接种量为2%，最适生长

4、时间是12h，菌株对污水COD降解率达到66%，丙烯酰胺除去率达到34.4%。关键词： 丙烯酰胺，降解，菌株，筛选，鉴定 Screening of acrylamide degradation bacteria and its application*Directed by Professor *AbstractDue to its peculiar free-pollution disposal, microbial degradation will become the effective methods to solve environmental pollution caused by

5、 acrylamide. By enhanced medium plus selective medium, from anaerobic Pond wastewater of Jiangxi chang nine agricultural chemical Co., LTD , obtain the bacteria which can degrade the acrylamide monomer, then optimized the biogenic and growth conditions. Measure the degradation performance of strains

6、, get a strain which has better degradation performance, Finally, physiological and biochemical preliminary identified as saprophytic staphylococcus. The optimal primary degradation conditions on mixed of the strain were as follows: optimal growth temperature is 33 , optimum pH 7.0, 2%amount of inoc

7、ulation, 12h of best degradation time，CODcr degradation rate is 66%，the removal rate of AM is 34.4%.Key words: acrylamide, degrade, strains, screening, identification 1 前言1.1 丙烯酰胺的应用丙烯酰胺(Acrylamide，简称AM)是一种无气味的白色晶体，在工业上主要用于合成聚丙烯酰胺(PAM)。PAM由于具有特殊的物理化学性质，因而广泛应用于石油开采、污水处理、造纸、矿产、医药、农业、纺织等行业，享有“百业助剂”之称。丙

8、烯酰胺具有神经毒性，可损伤周围神经系统和中枢神经系统，常人每天允许的最大暴露量不超过0.0005mg/kg1。化工医药行业的废水中常含有丙烯酰胺，对环境造成污染，危害人类健康。利用微生物的生命活动对废水中的污染物进行处理是目前最重要，最有发展前途，也是最常用的废水处理方法2。1.2 丙烯酰胺菌的危害急性毒性：急性毒性试验结果表明，大鼠、小鼠、豚鼠和兔的丙烯酰胺经口LD50为150-180 mg/kg，属中等毒性物质。 神经毒性和生殖发育毒性：大量的动物试验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒性；此外，为生殖、发育毒性。神经毒性作用主要为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性

9、变；生殖毒性作用表现为雄性大鼠精子数目和活力下降及形态改变和生育能力下降。大鼠90天喂养试验，以神经系统形态改变为终点，最大未观察到有害作用的剂量（NOAEL）为0.2 mg/kg天。大鼠生殖和发育毒性试验的NOAEL为2 mg/kg天。 遗传毒性：丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常，如微核形成、姐妹染色单体交换、多倍体、非整倍体和其他有丝分裂异常等，显性致死试验阳性。并证明丙烯酰胺的代谢产物环氧丙酰胺是其主要致突变活性物质。 致癌性：动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，包括乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子

10、宫、脑下垂体等。国际癌症研究机构（IARC）1994年对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2类致癌物（2A）即人类可能致癌物，其主要依据为丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为其致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。由于煎炸食品是我国居民主要的食物，为减少丙烯酰胺对健康的危害，我国应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国人群丙烯酰胺的暴露评估，并研究减少加工食品中丙烯酰胺形成的可能方法。对于广大消费者，专家建议： 1、尽量避免过度烹饪食品（如温度过高或加热时间太长），但应保证做熟，以确保杀灭食品中的微生物，避免导致食源性疾病。 2提倡平衡膳食，减少油炸和高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜。3、建议食品生产加

11、工企业，改进食品加工工艺和条件，研究减少食品中丙烯酰胺的可能途径，探讨优化我国工业生产、家庭食品制作中食品配料、加工烹饪条件，探索降低乃至可能消除食品中丙烯酰胺的方法。1.3 降解丙烯酰胺菌的研究意义丙烯酰胺既是化学试剂也是一种重要的工业原料，可以用它来聚合一种新型有机高分子絮凝剂，用于可产生较少污泥的污水处理中，但在丙烯酰胺的共聚物产品中，由于反应率不是100%,有少量的丙烯酰胺的单体（原料）残存在产品中，在制造应用丙烯酰胺聚合体的工业中，都会排出含有丙烯酰胺单体的废水，丙烯酰胺单体难于分解，且具有毒性，为避免环境污染，就需要寻找去除丙烯酰胺单体的方法。目前，降解有机污染物的处理技术中，应用

12、具有特殊分解能力的微生物的投菌法具有广阔的前景。本研究就是从从自然界中分离筛选降解丙烯酰胺的微生物菌种，并达到了试验预期的目标。2. 材料与仪器2.1 菌种来源从江西昌九农科化工有限公司厌氧池废水中筛选分离得到能够降解丙烯酰胺单体的菌株2.2主要药品和试剂实验中使用的药品和试剂如表1表1使用试剂名称，规格及厂家Table 1 Chemical reagents consumed in experiment名称规格生产厂家磷酸氢二钾分析纯成都市科龙化工试剂厂浓氨水分析纯天津市永大化学试剂开发中心氯化铵分析纯天津市永大化学试剂开发中心硝酸银分析纯天津市福晨化学试剂厂硫酸亚铁分析纯天津市福晨化学试剂

13、厂氯化钠分析纯天津市永大化学试剂开发中心重铬酸钾分析纯广东西陇化工厂硫酸亚铁铵分析纯天津市永大化学试剂开发中心盐酸分析纯南昌鑫光精细化工有限公司浓硫酸分析纯南昌鑫光精细化工有限公司蛋白胨生化试剂北京奥博星技术有限责任公司肌酸生化试剂上海蓝季科技发展有限公司甲基红生化试剂上海蓝季科技发展有限公司琼脂粉生化试剂上海蓝季科技发展有限公司牛肉膏生化试剂北京奥博星技术有限责任公司营养琼脂粉生化试剂上海蓝季科技发展有限公司氢氧化钠分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司葡萄糖分析纯成都市科龙化工试剂厂无水乙醇分析纯天津市福晨化学试剂厂2.3 实验仪器实验中所使用的仪器如表2表2使用仪器名称，规格及厂家Tabl

14、e 2 Equipments used in experiment名称规格型号生产厂家隔水式电热恒温培养箱GSM-350-BS-上海新苗医疗器械制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱PHG-9240A上海精密实验设备有限公司电子天平MP502B上海精科天平分析天平JA5003N上海精密科学仪器有限公司不锈钢手提式灭菌锅DSX-280A上海申实医疗器械厂全自动高压灭菌锅HVE-50日本洁净工作台SW-CJ-IF苏州安泰空气技术有限公司可见分光光度计WFJ7200型龙尼柯（上海）仪器有限公司pH酸度计pHS-25型上海雷磁仪器厂恒温培养摇床HWY-100B上海智城分析仪器制造有限公司冰箱BCD-216YH

15、海尔冰箱2.4 培养基2.4.1 选择性培养基表3培养基的配制Table 3 Medium compound葡萄糖10g/lCaCl20.1g/lK2HPO41.0g/lFeCl30.01 g/lMgSO40.5g/lNaCl0.3 g/l丙烯酰胺0.5g/lPH 控制在7.02.4.2 葡萄糖氧化发酵培养基表4培养基的配制Table 4 Medium compound蛋白胨10 g/lNaCl5 g/lK2HPO40.2 g/l葡萄糖10 g/l琼脂6 g/l1%溴甲酚紫3ml蒸馏水1000ml用氢氧化钠调pH7.0-7.2，分装试管，115蒸汽灭菌20min。2.4.3 甲基红试验和V-P

16、试验培养基表5培养基的配制Table 5 Medium compound蛋白胨5 g/l葡萄糖 5 g/lNaCl5 g/l蒸馏水1000ml调pH7.0-7.2，115灭菌30min。3.实验方法及原理3.1降解丙烯酰胺菌筛选流程优势菌生理生化性质测定从废水中富集培养菌株菌株生长条件优化及污染物降解率测定用选择性培养基筛选出优势菌株菌种的纯化（反复划线培养进行分离、纯化）数据处理和结果分析3.2 菌株的富集实验样品采自江西昌九农科化工有限公司厌氧池带污泥废水，将所采集的带污泥废水1ml接入50ml已灭菌的富集液体培养基中，在30旋转式摇床（转速150r/min ）培养1天。3.3 菌株的分离

17、纯化采用两次单细胞挑取法使初步分离的微生物得到纯培养3。（1）观察菌落形态特征，发现初步分离的微生物大致有两种。用灭菌的竹签从稀释涂布平板法得到的平板上挑取单菌落进行平板划线分离。（2）用灭菌的竹签从第一次划线分离得到的平板上再挑取单菌落进行平板划线分离。（3）待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（4）将已经纯化的两株菌种分别接种于试管斜面，做好标记。3.4 菌种的生理生化鉴定4-5实验参照简明第八版伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册对筛选的细菌进行生理生化性质测定，将细菌初步鉴定到属。

18、鉴定方法主要有革兰氏染色法、接触酶试验、甲基红试验、V-P实验、葡萄糖氧化发酵实验。3.4.1 革兰氏染色挑取少量菌苔涂布在载玻片上，风干，在火焰上固定涂片，滴加结晶紫染色1-2 min，水洗，滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min，水洗。用滤纸吸去载玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。用番红液复染约2 min，水洗。干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的为革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。3.4.2 接触酶试验将培养24 h的斜面接种，以玻璃棒沾取少许涂在3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。3.4.3

19、 甲基红试验培养基：蛋白胨，5 gL-1；葡萄糖，5 gL-1；K2HPO4，5 gL-1。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。3.4.4 V-P试验培养基同甲基红试验。取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10 min如培养液出现红色，即为试验阳性反应。3.4.5葡萄糖氧化发酵实验取葡萄糖发酵培养基本试管3支，分别接入要鉴定的两株菌株，第三支不接种，作为对照。接种后轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，将接种过和作为对照的试管放置30培养2448h，发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色，气体的产生可由试管中倒置的德汉式小管中有无气泡来证明

20、。3.5 重络酸钾法测COD6-8（1）方法原理在强酸性溶液中，用一定量的重铬酸钾氧化水样中还原性物质，过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴。根据硫酸亚铁铵的用量算出水样中还原性物质消耗氧的量。（2）干扰及消除 酸性重铬酸钾氧化性很强，可氧化大部分有机物，加入硫酸银作催化剂时，直链脂肪族化合物完全被氧化，而芳香族有机物却不易被氧化，吡啶不被氧化，挥发性直链脂肪族化合物、苯等有机物存在于蒸气相，不能与氧化剂液体接触，氧化不明显。氯离子能被重铬酸钾氧化，并且能与硫酸银作用产生沉淀，影响测定结果，故在回流前向水样中加入硫酸汞，使成为络合物以消除干扰。氯离子含量高于1000mg/L的

21、样品应先做定量稀释，使含量降低至1000mg/L以下，再进行测定。（3）方法的适用范围用0.25mol/L 浓度的重铬酸钾溶液可测定大于50mg/L的COD值，未经稀释水样的测定上限是700mg/L。3.6 丙烯酰胺降解率的测定取1ml菌株接入含1.0mg/ml丙烯酰胺的5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30培养24h，再将菌体接入含1.0mg/ml丙烯酰胺的5ml无机盐培养基中，以丙烯酰胺为唯一碳源，30培养2天，12000r/min离心5min，取菌上清液于紫外分光度计测定紫外吸收值（A280）的变化，以A280的变化值代表丙烯酰胺的降解能力。降解率=（未添加降解菌的A280-添加降解菌的A

22、280）/未添加降解菌的A2803.7 丙烯酰胺含量的测定为了确定丙烯酰胺的吸收波长，配制不同浓度的丙烯酰胺标准溶液，在UNICO UV-2100紫外分光光度计上进行扫描，最终确定丙烯酰胺的吸收波长为260nm，以下研究实验中均采用260nm的波长测定丙烯酰胺的含量9-11。丙烯酰胺标准溶液：准确称取0.5g 丙烯酰胺（含量99.9），溶解在去离子水中，定量转移入100ml 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液为5mg/ml 标准贮备液。丙烯酰胺标准曲线：在12只具塞试管中，分别加入0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0ml 标准溶

23、液，各加水至5.00ml，配成0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0mg/ml 标准系列。在紫外分光光度计上260nm处测定不同浓度的丙烯酰胺溶液随吸光度变化的标准曲线。测量数值如表6所示，标准曲线如图1。相关系数R2=0.9592，曲线方程为y=0.7152x+0.5588。表6 标准浓度AM溶液的吸光值Table 6 The light-absorbing values of standard concentration solution of AM浓度（mg/ml）吸光值浓度（mg/ml）吸光值0.00.3611.01.

24、2420.050.4701.21.4560.10.6721.41.5750.30.8671.61.6930.51.0261.81.8150.71.2422.01.903图1丙烯酰胺标准曲线Fig.1 Standars curve of acrylamide4. 结果与分析4.1降解丙烯酰胺菌的分离经稀释平板涂布筛选了两种菌株菌株1的形态特征：圆形规则，菌落较大，湿润，乳白色，透明菌株2的形态特征：圆形规则，菌落小，干燥，白色，半透明4.2 优势菌的菌体染色及形态鉴定4.2.1 菌体染色由图中可以看出，菌株1为革兰氏阳性杆菌，菌株2为革兰氏阴性菌。 (图2)菌株1 简单染色 (图3) 菌株2 简

25、单染色Fig 2 Simple stained Fig 3 Simple stained （图4）菌株1革兰氏染色 （图5）菌株2革兰氏染色Fig 4 Gram stain Fig 5 Gram stain4.2.2 生理生化鉴定（1）接触酶实验，菌株1与菌株2均没有气泡产生，阴性；（2）糖氧化发酵，菌株1和菌株2均变黄，没有气泡；（3）甲基红试验，菌株1为红色，阳性，菌株2为黄色，阴性；（4）V-P实验，菌株1与菌株2均不变红，阴性。图8 甲基红试验（右边为对照） 图9 V-P试验（右边为对照）Fig 8 Red-Test (On right side for control) Fig 9

26、V-P-Test(On right side for control)4.3菌株生长条件优化丙烯酰胺是具有毒性的有机物，需向培养液中添加营养元素以促进微生物生长从而使丙烯酰胺降解。实验确定了外加碳源、氮源、磷源及其最佳浓度，优化了菌株在纯培养条件下降解丙烯酰胺的最佳生长条件【12-14】。4.3.1降解时间的影响将优势菌株进行斜面培养，再用无菌水洗，制成菌悬液，记录不同时间下菌株的生长情况，取6h、12h、18h、24h、30h、36h六个时间点。图8降解率随时间的变化曲线Fig.8 The change of degrading rate in vegetation process of t

27、he bacteria4.3.2 接种量的影响将最优菌株向培养基中分别按不同的体积分数1%、2%、3%、4%、5%接种，在已优化的条件下培养2天后测定丙烯酰胺的降解率。图9降解率随接种量的变化曲线Fig.9 the degrading rate under different amount of inoculation4.3.3培养温度的影响分别设定了不同的生长温度，在同等条件下培养。测定不同温度20、25、30、35、40下最优菌株对1000 mgL-1AM溶液的降解效果。对丙烯酰胺溶液的降解率进行了测定，从而确定了降解实验的最佳温度。图10降解率随温度的变化曲线Fig.10 the deg

28、rading rate under different temperature4.3.4初始pH值的影响 将优势菌株进行斜面培养1天，再用无菌水洗，制成菌悬液，用已灭菌的移液管取等量分别倒入pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的液体培养基置于30、200rpm摇床培养进行，1天后测其菌浓，从而确定最适pH。图11降解率随pH值的变化曲线Fig.11 the degrading rate under different pH4.4污水COD值测定具体操作如下【15-16】（1）取20.00ml混合均匀的水样（或适量水样稀释至20.00ml）置于250ml磨口的回流锥形瓶

29、中。于试料中加入10.0mL重铬酸钾标准溶液和几颗防爆沸玻璃珠摇匀。将锥形瓶接到回流装置冷凝管下，接冷凝水。从冷凝管壁上端缓慢加入30mL硫酸银硫酸试剂，以防止低沸点有机物逸出。自溶液开始沸腾起回流2小时。注1 对于化学需氧量高的废水样，可先取上述操作所需提及的1/10的废水样和试剂，于15150mm硬质玻璃试管中，摇匀，加热后观察是否变成绿色。如溶液显绿色，再适当减少废水取样量，直至溶液不变绿色为止，从而确定废水样分析时应取用的体积。稀释时，所取废水样量不得少于15ml，如果化学需氧量很高，则水样应多次稀释。注2废水中氯离子含量超过30ml/L时，应先把0.4g硫酸汞加入回流锥形瓶中，再加2

30、0.00ml废水（或适量废水稀释至20.00ml），摇匀。以下操作同上。（2）冷却后，用90mL水自上冲洗冷凝管，取下锥形瓶，用水稀释至140mL左右。溶液冷却至室温，加入3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，颜色由黄经蓝绿色变为红褐色为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液消耗毫升数V2。（3）测定水样同时，以20.00ml重蒸馏水，按同样操作步骤作空白试验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。（4）计算COD （mg/L）=C(V1V2)8000/V0 C-标准溶液浓度，mol/L V2-试料测定时标准溶液消耗的体积，mlV1-空白实验标准溶液消耗的体积， V0-试料体积，ml8000-

31、1/4 O2的摩尔质量，以mg/L为单位的换算值4.4.1菌株对污水COD降解结果表3.两种菌株降解废水COD的能力Table 3 Two strains of ability. COD degrading wastewater废水COD浓度（mg/L）降解前降解后降解率（%）菌株15000170066菌株24800200058.34.4.2 菌株对丙烯酰胺除去率结果表4.两种菌株降解丙烯酰胺的能力Table 4 Two strains degradation of acrylamide ability丙烯酰胺浓度（1.0mg/mL）未添加降解菌的A280添加降解菌的A280除去率（%）菌株1

32、1.2420.81534.4%菌株21.2420.92625.4%5.结论(1)通过本实验的研究，可以知道：菌株1为革兰氏阳性杆菌，菌株2为革兰氏阴性菌。其中菌株一的降解率要高，所以优势菌株可选菌株一.（2）最适生长温度为33，最适生长pH为7.0左右，最佳接种量为2%，最适生长时间是12h，菌株对污水COD降解率达到66%，丙烯酰胺除去率达到34.4%。参考文献1 张学佳,纪巍,王宝辉等.丙烯酰胺生态毒理行为研究进展.生态毒理学报J,2008(3):217-2232 孔繁翔.环境生物学M.北京:高等教育出版社.2000,200-201.3 Asano Y, Yamada H. A new e

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35、nizar, J.Ramli, et al. Isolation and characterization of an acrylamide-degrading Antarctic bacterium J.Journal of Environmental Biology, 2009, 30(1):107-112.8 刘衍余,王苏平,杨菁.化工百科全书（第一卷）.北京,化学工业出版,1990,70-75.9 陈庆国. 聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究.10 孙韦强,伍登熙,尹光琳等.利用微生物生产丙烯酰胺的研究.生物工程学报,1989,5(2),169-17211 沈寅初，

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