食品微生物检验基本常识与方法ppt课件.ppt

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1、1,食品微生物检验基本常识与方法,食品学院韩 新 锋,2,食 品 微 生 物 检 验 的 范 围,食品的检验,生产环境的检验,车间用水空气地面墙壁,原辅料检验,食用动物、果蔬谷物添加剂,食品加工、储藏、销售诸环节的检验,食品从业人员的卫生状况加工工具运输车辆包装材料,出厂食品可疑食品食物中毒食品的检验,第一节 食品微生物检验的范围,3,生产环境的检验,4,原辅料的检验,5,食品加工、储藏、销售储环节的检验,6,成品食品的检验,7,8,第二节 食品微生物检验的指标,我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌。,9,1、菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度

2、和培养时间）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。,10,1、菌落总数定义：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。,意义：是判断食品卫生质量的重要依据之一。（1）可以反应食品的新鲜度。（2）可以反应食品被细菌污染的程度。（3）生产过程中食品是否变质。（4）食品生产的一般卫生状况等。,11,2大肠菌群包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及温血动物肠道内的常居菌，它随着大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。,12,意义：以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量，具有广泛的意

3、义。,13,3致病菌致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应选择一定的参考菌群进行检验。例如：海产品以副溶血性弧菌作为参考菌群，蛋与蛋制品以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为参考菌群，米、面类食品以蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群，罐头食品以耐热性芽胞菌作为参考菌群等等。,14,4霉菌及其毒素有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等。,15,第三节 微生物检验实验室,实验室,微生物检验室,无菌室,无菌室,缓冲间,（一）微生物检验室基本条件,16,

4、总要求：对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌条件。,17,基本条件：微生物检验实验室必须具备显微镜工作，微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本条件。,18,具体要求：1、光线明亮，但避免阳光直射室内；2、洁净无菌，地面与四壁平滑，便于清洁和消毒；3、空气清新，应有防风、防尘设备；4、要有安全，适宜的电源和充足的水源；5、具备整洁、稳固、适用的实验台，台面最好有耐酸碱、耐腐蚀的黑胶板；6、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱柜。,19,20,无菌室结构与灭菌（一）无菌室的结构与要求1、无菌室的结构结构：无菌室通常包括缓冲间和工作室两大部分。大小：为了便于无菌处

5、理，无菌室的面积和容积不宜过大，以适宜操作为准，一般可以为912m2；无菌室的大小，应按照每个操作人员占用面积不少于3m2设置。缓冲间与工作间二者的比例可为12，高度2.5m左右。,21,配置：工作间内设固定的工作台、紫外灯、空气过虑装置和通风装置；较为理想的应有空调设备、空气净化装置，以便在进行微生物操作时切实达到无尘无菌。注意：工作间的内门与缓冲间的门力求迂回，避免直接相通，减少无菌室内空气流动，以便保持工作间的无菌条件。窗户应装有两层玻璃，以防外界微生物进入。,22,检验室建设布局图,23,2、无菌室的要求内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于刷洗消毒；应保持密封、防尘、清洁、干燥。进行操作

6、时，应尽量避免走动；室内设备简单，禁止放置杂物；工作台、地面和墙壁可用新洁尔灭或过氧乙酸溶液擦洗消毒。,24,25,使用前准备：杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒，开灯照射30min后关灯，间隔30min后方可进入室内工作。,26,微生物实验室主要设备和器具,无菌室（接种室）或接种箱 恒温箱电烘箱（干燥箱）冰箱高压蒸汽灭菌锅离心机接种针天平酒精灯显微镜常用玻璃器皿均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀,27,第四节 培养基与试剂的基本要求,培养基的种类按照功能来分 基本培养基常用的有牛肉浸液、牛肉消化汤、普通营养琼脂、蛋白胨水等。仅能满足微生物野生型

7、菌株生长需要的培养基,28,选择性培养基根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。如培养肠道致病菌的SS培养基，含有胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌，还含有柠檬酸钠和煌绿，能抑制大肠杆菌，这样就使致病菌沙门氏菌和志贺氏菌容易生长。培养基中加入某些抗生素，也可起到选择性作用。,29,鉴定培养基在无糖的基础培养基（蛋白胨水）中加入乳糖和指示剂，接种后培养，若微生物能发酵乳糖产酸，则指示剂变色；若不发酵乳糖，则颜色不变。常用的糖发酵管、硫化氢培养基等都是鉴定培养基。半固体培养基也是鉴定培养基，因为它可以用来做穿刺

8、试验，从而鉴别微生物是否运动，以确定其是否有鞭毛。,30,一些鉴别培养基,31,特殊培养基许多微生物在一般培养基上不能生长或生长不良，往往是由于它们的营养要求特殊。如果在基础培养基中加入其他的营养物质，如血液、血清、酵母浸膏、生长因子等，那么可供营养要求较高或有特殊营养要求的微生物在其中生长。例如溶血性链球菌，在含有血液的培养基中，才能生长良好。,32,按对培养基成分分类 天然培养基是一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清

9、、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝卜汁、椰子汁等，嗜粪微生(coprophilous microorganisms)可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。,33,合成（组合）培养基是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室范围内他有关研生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等.半组合培养基指一类主要由化学试剂配制，同时还添加某些天然成分的培养基。以更有

10、效地满足微生物对营养物的需要。如马铃薯蔗糖培养基,34,按照培养基性状来分固体、液体、半固体培养基,35,2.培养基原料的质量控制培养基原料的质量控制主要是琼脂、蛋白胨、胆盐、牛肉膏及酵母浸膏等的质量控制。琼脂：分为琼脂粉和琼脂条，要求其溶于水后，pH值约为7，透明无沉淀，用量不宜过多，一般为1.52.0（质量分数）。,36,蛋白胨：应为干燥的白色或微黄色的细粉末，pH值约为7而偏酸性，能溶于水。不同的微生物可利用不同的蛋白胨，在配制培养基时，应根据微生物的要求进行选择。胆盐：应为浅黄色粉末，种类很多，可来自猪、牛、羊、兔等。不同的胆盐有不同的抑菌作用，因此应根据培养基的要求进行选择，不能互相

11、代替。牛肉膏及酵母浸膏：应为棕褐色半固体，溶于水后应透明无沉淀。在培养基中加入牛肉膏及酵母浸膏后，应观察培养细菌的生长情况，以对其效果进行检测。,37,3）培养基性能的控制 物理性状主要是透明度、pH值、硬度等。培养基应有较好的透明度，若有浑浊、沉淀现象，则会直接影响对细菌生长情况的观察。培养基的pH值应严格按照要求进行校正，对于一些生化反应培养基，pH值的正误直接影响细菌的反应结果和对其进行判断。固体培养基的硬度要适中，过硬不利于细菌的生长，过软又不利于划线分离。保存菌株和观察其运动性的半固体培养基的硬度也很重要，一般要根据琼脂的质量适当考虑。,38,生物学要求：微生物只有在适宜的培养基上，

12、才能表现出应有的生物学特性，而不同的微生物有不同的培养要求。一些常用的选择性培养基，除了对非目的菌有抑制作用外，对目的菌或多或少也有一定影响，因此就必须了解目的菌对该种培养基的敏感程度和适应性。细菌在不同的培养基上，其菌落的大小、形态特征及颜色的表现是不同的，要检测培养基的性能如何，应选择有代表性的典型菌进行分离培养，观察其菌落的生长情况是否典型。,39,4）染色液的质量控制：在将染色液配制好后，应选用标准菌株做阳性和阴性对照试验，从而鉴定其染色的性能。5）各种诊断血清的质量控制：许多致病菌都要进行血清学诊断。,40,第五节 食品微生物检验的一般程序,食品微生物检验的一般步骤检验前的准备样品的

13、采集样品的送检样品的处理方法致病菌检验参考菌群的选择样品的检验检验结果的报告,41,一.食品微生物检验的一般步骤,样品采集,样品处理,样品保存,选择参考菌群,检验前的准备,菌落总数,大肠菌群,致病菌,分离培养,分离培养,增菌,纯化,染色镜检,生化试验,血清学试验,动物试验,结果报告,42,二.检验前的准备,准备好所需的各种仪器。按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必需培养基。做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌3060min.工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便

14、出入无菌室。,43,三.样品的采集,44,（一）采样的目的和意义,便于食品卫生质量监督管理鉴别食品中是否存在有毒有害物质。为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。,45,（二）样品的种类,大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；小样，也称检样，做分析用的，一般为25g。,46,（三）采样的步骤,采样前调查现场观察确定采样方案采样 样品封存 开具采样证明,47,（四）采样的要求,1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有

15、二人以上参加。,48,1、食品微生物检验的取样方案,检验目的：检验食品的微生物卫生指标是否合格。,（五）食品微生物检验的采样方案,49,ICMSF（国际食品微生物标准委员会）方法从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。,我国GB4789.1-2010也将此采样方案列为国家标准。,50,在进行详细叙述之前，先解释四个代号：n：系指同一批次产品应采集的样品件数。c：最大可允许超出m值的样品数。m：微生物指标可接受

16、水平的限量值。M：微生物指标的最高安全限量值。,51,根据危害度的分类，将取样方案分成二级法和三级法。二级法：设定取样数n，指标值m，允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。,二级抽样方案:自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼的副溶血性弧菌为例，n=5，c=0，m=100，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，不得有超过m值（100）的检样，此批货物为合格品。如果c 0表明该批产品不合格。,52,三级法：设定取样数n，指标值m，附加指标值

17、M，介于m与M之间的样品数c。按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有c个样品其相应微生物指标值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。,例如：冷冻生虾的菌落总数标准n=5，c=3，m=10，M=100，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌落总数是在mM值（10100）之间，如果有3个以上检样的菌落总数是在mM值（10100）之间或一个检样菌落总数超过M值（100）者，则判定该批产品为不合格品。,53,ICMSF对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明：为了强调抽样与检样之间的关系，ICMS

18、F已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。,54,I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品；类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变；类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档,55,表2-1 ICMSF按微生物指标的重要性和食品危害度分类后确定的取样方案,56,（六）食品微生物检验采样方法,采样原则：能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样。,57,1.液体样品采样方法,

19、充分混匀后，无菌操作打开包装，用100 mL无菌注射器抽取，注入无菌盛样容器。,58,2.半固体样品采样方法,无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。,59,3.固体样品采样方法,大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。,60,4.冷冻食品采样方法,大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，

20、应从深部取样。,61,5.生产工序监测采样,车间用水：从车间各龙头采样；车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2无菌采样板或5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。,62,车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。,平皿,63,（七）采样标签的填写,标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。,64,采样单样品编号：产品名称（商品名）_规格型号_注册商标_ 生产厂家_通讯地址_邮政编码 受检地点_通讯地址_邮政编码

21、采样地点_采样日期_采样基数_生产日期_批号_产品依据标准_有效成分及含量_检验目的_检测项目_ 采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法 性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字 签字 日期年月日 日期 年月日 备注,65,四.样品的送检要求,1.要快速运送：不要超过3小时；2.若路途遥远，可在15低温下运送；3.要注意防污染、防散漏、防变质；4.要填写检验申请单。,66,五、样品的处理方法,（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品,67,（一）液体样品的处理,瓶装液体样品

22、的处理盒装或软塑料包装样品的处理,68,1.瓶装液体样品的处理,用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。,69,2.盒装或软塑料包装样品的处理,将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。,70,（二）固体样品的处理,捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法,71,1.捣碎均质法,将中样（100g）剪碎或搅

23、拌混匀，取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。,72,2.剪碎振摇法,将中样（100g）剪碎或搅拌混匀，从中取25 g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40 cm。,73,3.研磨法,将中样（100g）剪碎或搅拌混匀，从中取25 g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。,74,4.整粒振摇法,直接称取25 g整粒样品置于带有225 mL稀释液和直径5 mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅

24、要大于40cm。,75,（三）冷冻样品,冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18 h，或在45 下解冻，时间不能超过15 min。再取检样25 g做稀释处理。,76,六、致病菌检验参考菌群的选择,77,蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母菌、霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌,78,七、样品的检验,（一）收样 1.收到样品后逐一核对验收，登记编号；如2004年收到的50号样品，编号可写成：

25、2.立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。,79,（二）检验,1、选择检验方法：国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧盟标准等,80,2、检验要求,（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。,81,3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；

26、（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检,82,八、检验结果的报告,经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份。将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”、CMA章和中心公章后对外发文。收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。,83,第六节 菌落总数的测定,一、菌落总数与食品卫生质量目的：了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以

27、应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,84,菌落总数的几个概念,菌落总数：Aerobic Plate Count，食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基、温度、时间、pH、需氧性质等）所得1mL（g）检样中形成微生物菌落的总数。只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。CFU:Colony Forming Units，菌落形成单位。,85,意义：食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。是判断食品卫生质量的重要依据之一。（1）可以反应食品的新鲜度。（2）可以反应食品被细

28、菌污染的程度。（3）生产过程中食品是否变质。（4）食品生产的一般卫生状况等。,86,根据以上事实，食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起着一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。,87,国家标准中采用的培养方法是样品处理后倾注平板，36，培养482小时实际测定的是嗜中温好氧菌的菌落总数。菌落总数测定是对细菌的无差别培养，不能区分细菌种类，所以有时被称为杂菌数。,88,二、菌落总数的测定方法GB/T 4789.2-2010数据记录,89,90,菌落总数检验操作流程图,友情提示：若样品中可能含有表面蔓延生长的菌落时，可在培基凝固后再覆

29、盖一薄层培养基水产品置于30 1 培养72h 3h。,91,30cfu,300cfu,有较大片状菌落生长者不宜采用，若片状小于平板一半时且余部均匀分布，则以半个平板菌落数2倍报告无明显界限链状菌落每条单链视为一个菌落,选取菌落数在30300cfu之间，无蔓延生长的平板计数低于30的记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计，每个稀释度采用两个平行的均数,菌落计数方法,92,计数结果的表述,若只有一个稀释度平板在30300CFU，则计算两平行平板的均数，再乘以稀释倍数报告。若有连续两个稀释度符合计数要求则按下公式,例1：10-2=232，244 10-3=33，35例2：10-1=232，24

30、4 10-2=33，29,菌落总数,所有符合计数要求的平板菌落数之和,较低稀释度有效平板数,较高稀释度有效平板数,较低稀释度的稀释倍数,N=(232+244+33+35)(2+20.1）10-1,93,第七节 食品中大肠菌群的测定,一、大肠菌群的定义及范围大肠菌群(co1iform bacteria)系一群在37，24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及阴沟肠杆菌属。,94,一般认为大肠菌群都直接或间接来自于人或温血动物的粪便。粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体

31、外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。,95,大肠菌群的检出，不仅反映检样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。,96,大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目。如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。,97,三、大肠菌群测定的国家标准GB/T 4789.3-

32、2010,98,第一法 大肠菌群MPN计数法,99,大肠菌群计数检验流程,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不产气（-）小导管里无气泡,LST产气（+）,100,大肠菌群在LST中的生长情况,101,3、根据证实为大肠菌群阳性的管数，查找MPN检索表，报告每1ml（g）大肠菌群的MPN。,102,MPN法简介The Most Probable Number Method,103,大肠菌群测定MPN法检验几点说明,MPN检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定反应呈阳性管数的出现率，

33、用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。,104,105,第二法 大肠菌群平板计数法,106,第二法 VRBA平板计数法,选择15150平板计数典型和可疑菌落,361 18h 24h,挑选10个菌落接种到BGLB,典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，0.5mm,107,108,平板法检验步骤,1.样品的稀释2.选取23个适宜的连续稀释度，每个稀释度接接种2个无菌平皿，每个平皿1ml。设置空白对照3.及时将1520ml冷却至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。待琼脂凝固后，再加34ml VRB

34、A覆盖平板表层。翻转平板，置于37培养1824h。,109,4.平板菌落数的选择 15150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。5.正式试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别接种于BGLB肉汤管内，37培养2448h，观察产气情况。产气可报告为大肠菌群阳性。,110,大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠杆菌阳性的试管比例乘以相应平板计数的菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g（ml）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取

35、其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g(ml)=6.0105CFU/g（ml）,111,第八节 细菌的生化反应检查法,由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生化反应试验。,112,在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。,

36、113,生化试验的注意事项,1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。2、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。,114,糖（醇、苷）类发酵试验-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）七叶苷水解试验甲基红试验V-P试验,一、碳水化合物代谢试验,115,原理：多糖单糖丙酮酸酸性产物（或产酸产气）pH 指示剂呈酸性变色（若产气者有气泡出现）。培养基指示剂 酚红（PH：6.88.4）色泽变化（酸碱：黄红）,1.糖（醇、苷）类发酵试验,116,方法 将纯种细菌以无菌操作接种到含

37、有指示剂的培养基中，置35温箱培养数小时至两周，观察结果,伤寒沙门菌,甲型副伤寒,117,注意：表示的方法,118,应用：主要用于肠杆菌科的鉴定。,119,原理：有-半乳糖苷酶的细菌，可以分解邻硝基酚-半乳糖苷(ONPG)，而释放黄色的邻硝基酚。,2.-半乳糖苷酶试验（ONPG）,120,方法：取新鲜细菌一环，加入到0.25 ml的无菌生理盐水中，加甲苯一滴充分振动，37、5min，再加入无色ONPG溶液0.25ml，置37水浴，悬液变黄则为阳性。应用：常用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。,121,阴性 阳性,122,原理：七叶苷可以被细菌分解为葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的Fe2+反应，

38、形成黑色化合物，使培养基变黑。,3.七叶苷水解试验,123,方法：将待检菌接种于七叶苷培养基上，培养后观察结果。应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。,124,125,4.甲基红试验,原理：细菌分解培养基中的葡萄糖丙酮酸大量混合酸培养基pH4.4以下甲基红试剂培养基变红。,126,方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中，35培养618小时后，往培养基中加入甲基红指示剂少许，观察结果。应用：主要用于大肠和产气肠杆菌鉴定。,127,空白对照 阴性 阳性,128,原理：某些细菌分解糖类丙酮酸继续脱羧乙酰甲基甲醇（碱性）空气氧化双乙酰+-萘酚、肌酸红色化合物。,5.V-P试验,129,方法：将待

39、检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35培养48h后按每ml培养基加入0.1ml含2肌酸或肌酐的40KOH溶液，数分钟或数小时后观察结果。应用：主要用于鉴别大肠和产气肠杆菌。,130,空白对照 阴性 阳性,131,靛基质试验硫化氢试验苯丙氨酸脱氨酶试验尿素酶试验,二、蛋白质类代谢试验,132,原理：含有色氨酸酶的细菌，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚能与对二甲氨基苯甲醛作用，形成红色玫瑰吲哚。,1.吲哚（靛基质）试验,133,方法：将待检菌接种于胰蛋白胨水中，35培养2448h，取出后沿试管壁缓慢加入靛基质试剂数滴，在两液面观察结果。应用：主要用于肠杆菌科中产气肠杆菌与大肠埃希菌的鉴别，常与MR试验

40、联用。,134,2.硫化氢试验,原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S与培养基中的铅盐或铁盐发生反应，生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀。,135,方法：将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基中，35、2448h，观察结果。应用：肠杆菌科的属间鉴定。,136,137,3.苯丙氨酸脱氨酶试验,原理：有苯丙氨酸脱氨酶的细菌，可以使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙铜酸与三氯化铁作用形成绿色化合物。,138,方法：琼脂斜面法：将待检细菌接种到苯丙氨酸琼脂斜面上，35培养2448h，取出，将三氯化铁试剂45滴滴于斜面上，观察结果。快速纸片法：将待检菌涂于苯丙氨酸纸片上，孵育15min，取出，滴加三氯化铁试剂，立即观

41、察结果。应用：多用于肠杆菌科的鉴定。,139,绿色阳性 黄色阴性,+,-,140,原理：产生尿素酶的细菌，能分解尿素产生氨和CO2，氨在溶液中形成碳酸铵，使培养基变碱，酚红指示剂变红。,4.尿素分解试验,141,方法：将待检菌接种于尿素培养基中，35培养1824h取出观察。应用：肠杆菌科属间鉴别。,142,143,144,枸橼酸盐利用试验硝酸盐还原试验,三、有机盐类试验,145,1.枸橼酸盐利用试验,原理：能利用枸橼酸盐的细菌，也能利用铵盐作为唯一的碳源，分解后生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由浅绿色变为深蓝色。,146,方法：将待检菌接种于含有枸橼酸盐和铵盐的西蒙和柯氏

42、培养基培养1824h后，观察结果。应用：主要用于肠杆菌科属间的鉴别。,147,蓝色为阳性绿色为阴性,+,-,148,原理：使硝酸盐还原的细菌能从硝酸盐中获得氧，使其成为亚硝酸盐或其它还原物。培养基中的亚硝酸基能与-萘氨和苯磺酸形成红色的N-萘氨偶氮苯磺酸。若出现红色现象则说明该菌还原硝酸盐。,2.硝酸盐还原试验,149,方法：取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜面上，35培养1824小时，然后依次加入含-萘氨和对氨基苯磺酸的试剂各1 mL，30s后观察结果。,150,应用：有助于鉴别肠杆菌科、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、布兰汉菌属、假单胞菌属等,151,红色为阳性无色为阴性,+,-,硝酸盐还原试验结果,1

43、52,细胞色素氧化酶试验过氧化氢酶试验凝固酶试验,四、酶类试验,153,1.氧化酶试验,原理：某些细菌具有细胞色素氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化成紫红色醌类化合物,154,方法：滤纸法：用洁净滤纸蘸取菌落，加一滴试剂，观察结果菌落法：直接在菌落上加试剂，观察结果纸片法：使用试剂浸泡制成的试剂纸片，取足够的菌落，观察结果。应用：用于科别鉴定试验。,155,滤纸法：阳性结果,纸片法：阳性、阴性结果,156,原理：有触酶的细菌能催化过氧化氢生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。,2.触酶试验,157,方法：用接种环取备检菌少许，置于洁净的玻片上，滴加3%的过氧化氢12滴，观察

44、结果。试管法：用洁净的玻棒蘸取待检菌少许，置于装有3%过氧化氢的试管内，观察结果。应用：用于革兰阳性球菌初步分属。,158,159,3.血浆凝固酶试验,原理：有些细菌能产生血浆凝固酶，可以使人和动物血浆中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，从而使血浆凝固。,160,方法：玻片法：取洁净玻片一张，加生理盐水两小滴于玻片两端，用接种环挑取待检菌落和对照菌均匀涂于盐水中，制成浓菌液，加兔或人血浆一滴于菌液中，观察结果。试管法：于3支试管中分别加入1:4稀释的血浆0.5ml，1支管加入待检菌肉汤培养物0.5ml，另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物0.5ml，35培养34h后观察结果。应用：主要用于金葡菌的鉴定。,血浆凝固酶试验方法,161,血浆凝固酶试验结果,162,血浆凝固酶试验结果,163,此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！,