高效液相色谱优选内容课件.ppt

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1、,第十三章高效液相色谱法HPLC,分析化学(下，第三版),1,行业借鉴#,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,2,行业借鉴#,主要内容,一、概述二、基本理论及条件选择三、各类高效液相色谱法四、影响分离的因素五、高效液相色谱仪六、超效液相色谱技术简介七、HPLC定量分析方法学考察八、HPLC应用,3,行业借鉴#,第一节 概述,一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点,4,行业借鉴#,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒

2、径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动相 柱效高（H，n）分析时间大大缩短 可以在线检测,5,行业借鉴#,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用

3、途广泛，占有机物的80%,6,行业借鉴#,续前,2流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,7,行业借鉴#,三、高效液相色谱仪流程图,8,行业借鉴#,续前,四、HPLC的特点和应用,“三高”“一快”“一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一

4、般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,9,行业借鉴#,第二节 基本理论和条件选择,一、塔板理论平衡理论 二、速率理论 Vander方程 三、HPLC法中分离条件的选择,10,行业借鉴#,一、塔板理论,11,行业借鉴#,二、速率理论（与GC对比）,1.,12,行业借鉴#,续前,2）涡流扩散项及其影响 next,2.,讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next,13,行业借鉴#,图示,back,14,行业借鉴#,续前,3）传质阻抗项及其影响,15,行业借鉴#,图示,16,行业借鉴#,三、HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择：

5、选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右,17,行业借鉴#,第三节 各类高效液相色谱法,一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）,18,行业借鉴#,一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异,分离前提：K不等或k不等,19,行业借鉴#,续前,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（10m）,（2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配

6、 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,20,行业借鉴#,续前,3流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂 例：正己烷或庚烷+氯仿-,4影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性，洗脱能力，k，tR 溶剂系统极性，洗脱能力，k，tR注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6硅胶吸水量，LSCLLC硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大硅胶含水量17%分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液,21,行业借鉴#,二、液液分配色谱法（LLC）,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理

7、或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,22,行业借鉴#,三、化学键合相色谱法（BPC）,（一）化学键合相（bond phase）（二）反相键合相色谱(reversed bond phase)（三）正相键合相色谱(normal bond phase)（四）离子对色谱和离子抑制色谱(ion-pair chromatography,ion-pre

8、ss chromatography),23,行业借鉴#,（一）化学键合相,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面,1分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2特点：1）不易流失 2）热稳定性好 3）化学性能好 4）载样量大 5）适于梯度洗脱,24,行业借鉴#,（二）反相键合相色谱,1分离机制：疏溶剂理论 正相流动相与溶质排斥力强，作用时间 k，组分tR 反相流动相与溶质排斥力弱，作用时间，k，组分tR2固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题）3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，TH

9、F,25,行业借鉴#,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5反相洗脱：强度因子S，见P291表13-5。水的洗脱 能力为0。6.出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱7适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,26,行业借鉴#,（三）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,27,行业借鉴#,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5正相洗脱：溶剂的洗脱能力主要参考极性参

10、数P（见P290 表13-3）。6.出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等,28,行业借鉴#,（四）离子对色谱和离子抑制色谱,1反相离子对色谱法（ion-pair chromatography）2反相离子抑制色谱(ion-press chromatography),29,行业借鉴#,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠

11、分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱,30,行业借鉴#,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH

12、=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,31,行业借鉴#,分离类型选择,32,行业借鉴#,第四节 影响分离的因素,一、分离度 二、流动相三、洗脱方式,33,行业借鉴#,1,34,行业借鉴#,续前,2对流动相的要求：,1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气,35,行业借鉴#,续前,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比

13、例 即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,36,行业借鉴#,图示,37,行业借鉴#,第五节 高效液相色谱仪,38,行业借鉴#,39,行业借鉴#,40,行业借鉴#,HPLC 仪器示意图,41,行业借鉴#,HPLC的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵液,分离,检测,记录,进样阀,进样,42,行业借鉴#,1泵：恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用2进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀,43,行业借鉴#,44,行业借鉴#,进样阀,样品,

14、装样,废液,淋洗液,至分离柱,六通阀,（）,（）,样品环,45,行业借鉴#,续前,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光,46,行业借鉴#,47,行业借鉴#,光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,48,行业借鉴#,49,行业借鉴#,50

15、,行业借鉴#,第六节 超效液相色谱技术简介（UPLC）,51,行业借鉴#,52,行业借鉴#,53,行业借鉴#,54,行业借鉴#,55,行业借鉴#,原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成,56,行业借鉴#,LC/MS联用可容纳600个色谱峰,57,行业借鉴#,第七节 HPLC定量分析方法学考察,准确度（回收率实验）精密度（重复性实验）检出限（3 S/N）定量限（10 S/N）线性范围（2个数量级）色谱系统适用性实验柱效（理论塔板数）分离度重复性拖尾因子,58,行业借鉴#,第八节 HPLC的应用,59,行业借鉴#,药物分析,60,行业借鉴#,食品分析,61,

16、行业借鉴#,环境分析,62,行业借鉴#,农药分析,63,行业借鉴#,例题,在反相色谱中，若以甲醇-水为流动相，适当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和保留时间的变化为（）。A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加C 样品的k增加，tR降低D 样品的k降低，tR增加,64,行业借鉴#,例题,在正相色谱中，若适当增大流动相极性，则（）。A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加C 相邻组分的增加 D 对基本无影响,65,行业借鉴#,例题,HPLC中的最佳流速uH与GC中的最佳流速uG比较结果是（）A uHuGB uHuGC uH=uG,66,行业借鉴#,例题,用ODS柱分析

17、一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是（）。A 增加流动相中甲醇的比例 B 增加流动相中的水的比例C 流动相中加人少量HAc D 流动相中加人少量的氨水,67,行业借鉴#,例题,在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭,68,行业借鉴#,例题,水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）A 正相色谱法B 反相色谱法C 吸附色谱法D 空间排阻色谱法,69,行业借鉴#,例题,键合相的键合基团的碳链长度增加后（）A 极性减小B 极性增大C 载样量增大D 载样量减小,70,行业借

18、鉴#,例题,在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）A 提高分配系数比B 容量因子增大C 保留时间增长D 色谱柱柱效提高,71,行业借鉴#,例题,二极管阵列检测器与一般分光光度计的主要差别是（）A 不需光谱扫描即可获得样品每个组分的 吸收光谱B 服从Lambert-Beer定律C 复光照射样品，而后再分光D 信号弱，需要累加,72,行业借鉴#,例题,内标对比法与内标一点法的区别是（）A 不需要加内标物B 不需要校正因子C 进样量不要准确,73,行业借鉴#,例题,用反相HPLC测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸为内标。方法如下：准确配制

19、1 mg/mL浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲酸对照溶液，精取芦丁对照溶液2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL，分别置于25 mL容量瓶中，同时各加入内标溶液2.00 mL，定容。各进样3次，进样量为10L。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之比的平均值分别为1.43、2.86、4.29、5.37和7.16。精称样品0.2070 g，溶解，定容于100 mL容量瓶中。精取10.00 mL于25 mL容量瓶中，同时加入内标溶液2.00 mL，定容。进样量为10L，3次进样得芦丁色谱峰面积与内标物峰面积之比的平均值为5.10，计算样品中芦丁的含量。,74,行业借鉴#,75,行业借鉴#,76,行业借鉴#,本章小结：,1、掌握高效液相色谱的速率理论表达式，并比较与GC的异同；2、掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及分类；3、掌握HPLC仪器组成和主要部件的特点；4、熟悉HPLC的常用分析模式及色谱条件；5、熟悉HPLC中分离度的影响因素式及分析条件的选择,77,行业借鉴#,习题与思考题,思考题P306307 1、2、3、4、5、7、8。习题P307 1、2、3、5、6。,78,行业借鉴#,