黄曲霉毒素的检测ppt课件.pptx

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1、中药中黄曲霉毒素检测方法研究,真菌毒素简介,是真菌在适宜的环境条件下，在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害,真菌毒素简介,黄曲霉毒素的起源,第一次发现黄曲霉毒素的起源事件：1960年，英国发现有10万只火鸡死于一种以前没见过的病，被称为“火鸡X病”，主要症状为食欲减退，羽翼下垂，染病后昏睡死亡，死时头脚向后伸。解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。再后来鸭子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些可怜的火鸡和鸭子吃的是花生饼。花生饼是花生榨油之后剩下的残渣，富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。科学家们很快从花生饼中找到了罪魁祸首，一种真菌产生的毒素。它被命名为“aflatoxin”，就是

2、现在所说的黄曲霉毒素。,黄曲霉毒素,点击录入内容,点击录入内容,点击录入内容,点击录入内容,显微镜下的黄曲霉,黄曲霉毒素的检测意义,毒性极强1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。,黄曲霉毒素的检测意义,毒性极强急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。,黄曲霉毒素的检测意义,存在极其广泛主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲

3、霉毒素的检出率比较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。,黄曲霉毒素的检测意义,存在极其广泛中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类中药；贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材,黄曲霉毒素的检测意义,国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多,黄曲霉毒素的种类及性质,根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物,ACCD PPT,B族：蓝色荧光,1,G族：黄绿色荧光,2,1,2,黄曲霉毒素的种类及性质,生长温度最低6-8，最高达44-46，32时黄曲霉毒素B1的产量最高。,黄曲霉毒素的种类及

4、性质,化学结构结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.,黄曲霉毒素的种类及性质,化学结构,主要分子型式,B1,B2,G1,G2,M1,M2,M1是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物,M1、M2主要存在于牛奶中,B1：最常见、毒性及致癌性最强,黄曲霉毒素化学结构式,黄曲霉毒素化学结构式,一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。原理：抗原、抗体反应，第一次发

5、现黄曲霉毒素的起源事件：追根溯源，最大的嫌疑是饲料。大米、植物油 10，微柱筛选法：半定量，测总量追根溯源，最大的嫌疑是饲料。黄曲霉毒素危害极大，应引起重视这些可怜的火鸡和鸭子吃的是花生饼。中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、粮谷类中药材或含此类药材的中成药；慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.薄层层析法：灵敏度低，定量困难中性溶液及弱酸性溶液中较稳定，强酸性溶液中稍有分解，强碱溶液中分解迅速B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化花生饼是花生榨油之后剩下的残渣，富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。测定：吸取混合对照品溶液

6、5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。黄曲霉毒素现有检测方法介绍混合对照品溶液的制备：液体标液（B1B2G1G2=10.历年中国药典标准收载状况中性溶液及弱酸性溶液中较稳定，强酸性溶液中稍有分解，强碱溶液中分解迅速黄曲霉毒素在样品中分布不均匀原理：抗原、抗体反应，,黄曲霉毒素化学结构式,理化性质,相对分子量为312-346,难溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中,中性溶液及弱酸性溶液中较稳定，强酸性溶液中稍有分解，强碱溶液中分解迅速,纯品为无色结晶.在紫外光灯下，B1、B2发蓝色荧光，G1、G2发绿色荧光,耐高温，一般烹调温度不能

7、破坏，B1的分解温度为268,紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,薄层层析法：灵敏度低，定量困难HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高（目前药典采用此法）,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳性多免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多微柱筛选法：半定量，测总量一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现场大批量初筛HPLC/MS/MS：不衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高,色谱学方法,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,免疫学方法,ELISA,胶体金

8、,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,2005年增补本附录：第一次增加了黄曲霉毒素测定法,历年中国药典标准收载状况,2010年版一部正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法,历年中国药典标准收载状况,历年中国药典标准收载状况,2010年版一部第二增补本：修订了附录方法删除了流速规定增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法取消了免疫亲和柱的品牌规定,2015年版总则草案,历年中国药典标准收载状况,增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法附注：当测定结果超出限度时,采用第二法进行确认,2351 黄曲霉毒素测定法,2015年版总则草案,历年中国药典标

9、准收载状况,粮谷类、种子类、油性成分多的品种应注意黄曲霉毒素的检测处方中含有易污染的药材以及生粉投料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测,9305 中药中真菌毒素测定指导原则,2015年版总则草案,历年中国药典标准收载状况,根据具体品种和具体污染状况，参考相关品种国外药典和各国、各国际组织相关限量标准等规定，尽可能控制在最低范围内B1 限量和 B1、B2、G1、G2 总和的限量,9302 中药有害残留物限量制定 指导原则,历年中国药典标准收载状况,2015年版正文未查到具体品种规定是否有变化,黄曲霉毒素药典检测方法详解,液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）衍生方式：柱后碘衍生、

10、柱后光化学衍生。混合对照品溶液的制备：液体标液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀释500倍。供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化。测定：吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液20-25l，测定。,追根溯源，最大的嫌疑是饲料。B1,B2,G1,G2,操作中可能出现的问题及注意点黄曲霉毒素的种类及性质中药黄曲霉毒素检测药典收载状况一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。相对分子量为312-346微柱筛选法：半定量，测总量黄曲霉毒素检测安全防护措施注意点：澄清、含醇量

11、、pH、流速、脱水检测前先多了解被检测物质和成分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化最低6-8，最高达44-46，32时黄曲霉毒素B1的产量最高。注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。取消了免疫亲和柱的品牌规定假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液质联用，关闭衍生器B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化,中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解,方法来源：中国药典2010年版第二增补本附录 V 黄曲霉毒素测定法 基本步骤提取过柱洗脱测定,样品前处理,免疫亲和柱纯化,柱后衍生、HPLC检

12、测,上样,洗涤,洗脱,检测流程,提取,过滤除杂,稀释,黄曲霉毒素检测主要设备,气孔操作架,免疫亲和柱,黄曲霉毒素检测主要设备,气孔操作架,免亲和柱,黄曲霉毒素检测主要设备,HPLC-荧光检测器,光化学衍生器,黄曲霉毒素检测主要设备,免疫亲和柱,IAC,洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来进入仪器检测,上样，载体上的抗体结合样品中的待测物,清洗，将杂质冲洗干净,抗待测物（半抗原）抗体,待测物（半抗原）,无关杂质,固相载体（凝胶）,免疫亲和柱的原理,用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成,方法详解,操作中可能出现的问题及注意点对照品溶液的配制 取样：混匀，严格按要求取样，

13、要有代表性提取：方式可比较后选择滤过:普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心,方法详解,操作中可能出现的问题及注意点净化和富集采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成原理：抗原、抗体反应，注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水 其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器洗涤,方法详解,黄曲霉毒素标液,supelco,黄曲霉毒素的衍生化,衍生原因 B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化药典附录收载的两种衍生方法碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗。光化学衍生法：紫外光灯（254）nm照射，操作简单，对衍生温

14、度无要求，无需冲洗,衍生原理,AFB1,AFG1,黄曲霉毒素的衍生化,紫外光灯照射,紫外光灯照射,增强B1、G1的荧光强度。,黄曲霉毒素的衍生化,黄曲霉毒素的检测,荧光检测器，激发波长=360nm(或 365nm)，发射波长=450nm 灵敏度高，可用于痕量检测,检测方法详解,方法难点：痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品黄曲霉毒素在样品中分布不均匀中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液质联用，关闭衍生器,报告具体值,低于检测限（标出检测限）,报告具体值,未检出,结果报告

15、,黄曲霉毒素检测安全防护措施,应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境黄曲霉毒素标准品禁用固体实验全程佩戴手套残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理。,总结,总结,黄曲霉毒素危害极大，应引起重视检测前先多了解被检测物质和成分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错检测过程中大家一定要注意安全措施的防护，保护好自己、保护好环境,谢谢大家！,黄曲霉毒素,点击录入内容,点击录入内容,点击录入内容,点击录入内容,显微镜下的黄曲霉,黄曲霉

16、毒素的检测意义,毒性极强急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。,黄曲霉毒素的检测意义,存在极其广泛中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类中药；贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材,黄曲霉毒素的种类及性质,化学结构结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.前者为基

17、本毒性结构，后者与致癌有关.,方法详解,操作中可能出现的问题及注意点净化和富集采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成原理：抗原、抗体反应，注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水 其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器洗涤,方法详解,黄曲霉毒素标液,supelco,检测方法详解,方法难点：痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品黄曲霉毒素在样品中分布不均匀中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液质联用，关闭衍生器,总结,黄曲霉毒素危害极大，应引起重视检测前先多了解被检测物质和成分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错检测过程中大家一定要注意安全措施的防护，保护好自己、保护好环境,