广东生物《DNA重组技术的基本工具》ppt课件.ppt

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1、基因工程,专题1,每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,通用,基因工程的产物,什么叫基因工程？,基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。,基因工程的

2、概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切,拼接,导入,表达,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,195

3、3年沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1958年梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1957年克里克等提出中 心法则,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PC

4、R技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子

5、手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,思考：,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？2.单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵却并没有在进化中灭绝，有何保护机制？,可能产生了一些特殊的酶来防范。这种酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,寻根问底,限制酶存在于原核生物中的作用是什么？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA

6、侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,思考与探究 P7（2）,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源：种类与命名：作用特点（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果：,识别特定核苷酸序列，并且使每条链

7、中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成，是回文序列。,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）,大肠杆菌（Escherichia coli R）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,T,磷酸二酯键,A,限制性内切酶与DNA解旋酶

8、的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,Go back,限制酶的识别序列：,Go back,能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,EcoR,黏性末端,黏性末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,

9、重复演示,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端平末端,Go back,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1.作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,2.作用原理：,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的缝隙“缝

10、合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,3.类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,1.形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条

11、互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,2.化学本质都是蛋白质（但组成和性质各不相同）,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,1、载体的作用,将 转移到受体细胞中去。,目的基因,2、种类,质粒（常用，最常用的质粒是大肠杆菌的）噬菌体的衍生物动植物病毒,3、载体需要的条件：有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。对受体细胞无害能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存有某些标记基因，便于筛选,假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目

12、的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,4、质粒是基因工程最常用的载体。,2）质粒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。,3）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。,4）质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,5）真正被

13、用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。,2,7,4,8,3,6,1,5,3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活

14、。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组DNA的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究

15、P7,什么是内含子和外显子？,原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的.真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫外显子，不能编码蛋白质的序列叫内含子。真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。,知识拓展,什么是内含子和外显子？,在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序

16、列隔开，这些间隔序列称为内含子。内含子（Intervening region）是一个基因中非编码DNA片断，它分开相邻的外显子。更精确的定义是：内含子是阻断基因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行转译前被剪除。在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。真核生物的基因含有外显子和内含子，是前者区别原核生物的特征之一。,知识拓展,知识拓展,关于内含子和外显子的说法正确的是（）A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNAB.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNAC.原核细胞基因中也有内含子和外显子D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区,知识拓展,B,Go back,思考与探究 P7,1、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,