第13章DNA的生物合成复制课件.ppt

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1、第13章 DNA的生物合成复制,DNA Biosynthesis：Replication,本章主要内容,中心法则 DNA的半保留复制 复制系统的特征 DNA复制的机制 DNA结构的完整性,重点与难点：大肠杆菌 DNA复制的过程、真核 生物DNA复制特点、DNA的损伤和修复。,Watson and Crick，1953人类科学发展历史上的伟大里程碑。,中心法则揭示了遗传信息的传递方向。,1958年F.Crick提出中心法则,从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用 下，生成与亲代相同的子代DNA或 RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对

2、原则 将其所含的遗传信息传给RNA，形 成一条与DNA链互补的RNA的过程。,几个重要概念,DNA的复制(replication),由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。,翻 译：以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA 顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作 用下，生成DNA的过程。,一、DNA的半保留复制,由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,1.概 念,(semi-conservative replication),2.半保留复制的实验证据,1958年Meselson

3、&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术，证明了DNA是采取半保留的方式进行复制。,15N DNA,14N-15N DNA,14N DNA,14N-15N DNA,亲代DNA分子,第一代DNA 分子,第二代DNA 分子,3.半保留复制的意义,使亲代DNA所含的信息以极高的准确 度传递给子代DNA分子。DNA通过复制和基因表达这两种主要 功能，决定了生物的特性和类型并体 现了遗传过程的相对保守性。,二、复制系统的特征,DNA的复制开始于一个特定的位点，称为复制起始点（原点，Ori）。在原核生物只有一个起始点，而在真核生物有多个起始点。从原点开始将DNA链解开，在复制的部分同时进行解链与合成

4、，形成一个分叉，称为复制叉（replication fork）。,两个起始点，两个复制叉一个起始点，一个复制叉双向复制：从一个起始点开始，沿两个相反方向各生长出两条链，形成两个复制叉。,复制的方向：,三、DNA复制的机制,原核细胞DNA的复制 真核细胞DNA的复制,（一）原核细胞DNA的复制,DNA复制起始的酶类及蛋白 DNA聚合酶 RNA引物 DNA连接酶 DNA复制的过程,1.DNA复制起始的酶类及蛋白,解螺旋酶（Helicase)：在复制的起始点上解开双螺旋。,解螺旋酶 解螺旋酶 Rep蛋白,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，出现超螺旋。,拓扑异构酶(DNA to

5、poisomerase),作用：解除由解链酶造成的拓扑张力，能够松解DNA超螺旋结构，兼具有内切酶和连接酶活力，能迅速使DNA链断开又接上。,单链DNA结合蛋白（single stranded DNA binding protein,SSB）,稳定已经解开成两股的DNA单链，与解开的单链 DNA 结合，防止其重新配对形成双链 DNA 或被核酸酶降解。,SSB的生理作用,1.稳定单链DNA，便于其作为模板复 制子代DNA；2.保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,2.DNA聚合酶,有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有从53 外切酶的活性，其作用

6、是切除引物。,DNA聚合酶 I：用于切除引物RNA，并填补留下的空隙,DNA聚合酶II：,活性弱,作用与聚合酶III相似5 3 聚合酶功能3 5 外切酶活性，无5 3 外切酶活性。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,DNA聚合酶III 主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能,由10种亚基组成。有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3 OH以3,5磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5 3；有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有53 外切酶活性。,以四种脱氧核糖

7、核苷酸（dNTP）作底物。,三种聚合酶的共性:,反应需要接受模板的指导，可以利用DNA双链作为模板，亦可以单链DNA作为模板。,反应需要有游离的3-羟基作为引物。聚合方向总是5 3。,PPi,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性（聚合酶I,III）,?,切除复制时合成的RNA引物。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,外切酶活性,3.RNA引物,所有的 DNA 聚合酶都要求一个有自由 3-OH 的引物来起始 DNA 的合成。这段 RNA 长 510 个核苷酸，由一种特异的 RNA 聚合酶合成，此酶称为引物酶（primerase）。引物酶只有复制起始的一些蛋白质形成引发体（primosome）才能催

8、化引物合成。,先导链(leading strand),随从链(lagging strand),引物,引物,引物,DNA聚合酶校对复制中的错误核苷酸，导致在形成新的磷酸二酯键前检测前一个碱基是否正确，决定了不能从头合成。先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来标记是“暂时”的。当DNA开始聚合以后在以53核酸外切酶的功能切除，以脱氧苷酸代替。,为何先合成RNA引物，然后切除？,增加了复制的复杂性，但保证了复制的忠实性。,4.DNA连接酶（DNA ligase）,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。

9、原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP。,DNA连接酶的作用,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,复制的起始,5.DNA复制过程,由解螺旋酶解链，形成复制叉，SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶与上述因子、酶构成引发体，并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。,复制的延伸,在DNA-pol III催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,dATP,dGTP,dT

10、TP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,半不连续复制在DNA复制时，前导链是连续合成的，而后随链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。,前导链连续复制,前导链（leading chain）：为连续合成，合成方向与解链方向一致。,后随链不连续复制,后随链的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从53 方向生成引物然后复制，为不连续合成，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。,后随链的合成,随从链,冈崎片段：,在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而后随链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其

11、发现者的名字命名为冈崎片段。真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。,复制延长简图,复制的终止,由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。复制的起始点和终止点刚好把环DNA分为两个半圆，两个方向各进行180，同时在终止点汇合。,最末端冈崎片断的RNA引物切除后可求助于另半圈DNA链向前延伸来填补,1.真核生物的双向复制,真核生物染色体有多个起始点，是多复制子的复制。由一个起始点控制的复制DNA单位称为一个复制

12、子(replicon)，复制子是独立完成复制的功能单位。,（二）真核细胞DNA的复制,2.真核生物的DNA聚合酶,参与DNA的修复,线性DNA的末端复制的问题,3.端粒(telomere)的复制,端粒:是指真核生物染色体线性DNA分子末端结构部分，通常膨大成粒状。,末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。,端粒的功能:,补偿RNA引物切除后造成的空缺，保证染色体复制的完整性。稳定染色体的末端结构。防止染色体间末端连接。,端粒酶(telomerase),含有RNA链的逆转录酶，能以RNA为模板合成端粒区的DNA片段。,端粒酶的爬行模型,当端粒长度下降到某一临界值时，细胞终止分裂：衰老、

13、死亡,“多莉”的衰老,研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命,研究推测端粒酶与肿瘤的关系,真核生物中DNA的复制特点,真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。冈崎片段长约200bp.真核生物DNA复制速度比原核慢。真核生物有多种DNA聚合酶。真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,四、DNA结构的完整性,1.DNA复制的忠实性,至少依赖三种机制:遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）复制出错时有即时的校读功能,2.DNA的损伤（DNA damage）

14、,个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段在DNA的构成、复制或表型功能上的异常变化，称为DNA损伤。也称为突变（Mutation）。,引发损伤的因素:,环境中的理化因素，如指紫外线和各种辐射及许多化学诱变剂，常常导致DNA突变。如紫外线可引起DNA链上相邻的两个嘧啶 碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。,如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,突变的分子改变类型:,点突变(错配,mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),镰刀形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基

15、,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,3.DNA损伤的修复（DNA repairing）,修复的主要类型：光修复(light repairing)暗修复:切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,（1）光修复,光修复过程是通过光修复酶催化而完成，可见光（300400nm）激活此酶活性，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，DNA完全恢复正常。,光修复酶(photolyase),分解环丁基的CC键,（2）切除修复（excision repairing）,又称复制前修复。在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉

16、，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。,E.coli的切除修复方式,（3）重组修复（recombination repairing）,复制后通过分子内重组，从完整的亲代链上把相应碱基顺序的片段移至子代链缺口处，使之成为完整的分子。亲链上的缺口由聚合酶和连接酶填补完整，称为重组修复。,重组修复DNA示意图,（4）SOS修复（产生差错的修复）,DNA严重受损时复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。反应特异性低，对碱基的识别和选择能力差，DNA得到了修复但导致变异。DNA保留的错误会较多，引起较广泛、长期的突变

17、。致癌因素X射线、紫外线和黄曲霉素导致SOS修复。,4.DNA重组,在体外，将一种外源DNA和载体DNA重新组合连接，形成杂交DNA，然后将其转入宿主细胞，最终使外源DNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达，从而改变生物原有遗传性状的过程，称为重组DNA技术。它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为“遗传工程”，亦即“基因工程”。,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶 逆转录酶 T4 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶,工具酶,重组DNA技术的基本操作过程:,目的基因的获取选择目的基因载体将外源基因与载体的连接将重组体导入受体

18、细胞阳性克隆（重组体）的筛选和鉴定DNA重组体的扩增、表达等研究,化学合成基因从基因组DNA中切割、分离目的基因片段构建cDNA文库，调取目的基因PCR体外特异扩增,（1）目的基因的获得,多聚酶链式反应(PCR),20世纪80年代末发展起来的一种 DNA 特定片段体外快速合成扩增的方法。称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）,微量离心管，适量的缓冲液，模板DNA，2个DNA引物，4种dNTP，Taq DNA聚合酶和Mg2+。,（2）载体的选择和制备,原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞

19、中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。,能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主 DNA，称为载体（vector）。,目的基因与载体的连接,（3）,(4)重组DNA导入宿主细胞,大肠杆菌、酵母、真菌及各种真核细胞、受精卵细胞都可用于重组。,转化,转染,（5）重组体的筛选和鉴定,遗传学方法核酸杂交法PCR方法 酶切鉴定,五、特殊复制机制,线粒体DNA复制 单链DNA复制 病毒RNA复制,逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成DNA的特殊复制方式（在某些生物如鸡的肉瘤病毒等）。这个过程由逆转录酶催化，它具有以单链RNA为模板合成与其互补的DNA（cDNA），再水解杂交链上的RNA以及以cDNA为模板合成双链DNA三种酶活性。逆转录现象和逆转录酶（reverse transcriptase）（H.Temin，1976）是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重要补充。,单链DNA复制 逆转录作用（reverse transcription）,逆转录作用图,思考题,1.DNA聚合酶的功能。2.半保留复制、半不连续复制、冈崎片段。3.参与DNA复制的主要酶及蛋白的作用。4.原核生物复制的过程。5.在DNA复制过程中，遗传信息的忠实性如何得到保证？6.DNA的损伤和修复系统。7.DNA重组的概念及一般过程,