生化检测与控制生物传感器课件.ppt

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1、传感器（电极或探头）：能感受规定的被测量并按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械结构和线路组成。生物传感器：是利用酶、抗体、微生物等作为敏感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进行检测的传感器。,2.3 生物传感器,2.3.1 生物传感器工作原理,工作原理：待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层，经分子识别而发生生物学作用，产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。,（1）将化学变化转变成电信号,酶传感器为例,酶催化特定底物发生反应,从而使

2、特定生成物的量有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器.常用转换装置有氧电极、过氧化氢。,（2）将热变化转换成电信号,固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化.例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围.这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中.,（3）将光信号转变为电信号,例如，过氧化氢酶,能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光,因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端,再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量.还有很多细菌能与特定底物发生反应,产生荧

3、光.也可以用这种方法测定底物浓度.,上述三原理的生物传感器共同点：都是将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应,将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量,这种方式统称为间接测量方式.,（4）直接产生电信号方式,这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接(或通过电子递体的作用)在电极表面上发生.根据所得的电流量即可得底物浓度.,2.3.2 生物传感器发展历程,开端于 20 世纪 60 年代。1962 年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果,可认为是最早提出了生物传感器(酶传感器)的原理。1967年Updike等人实现了酶的固

4、定化技术,研制成功酶电极,这被认为是世界上第一个生物传感器。,20世纪70年代中期后,生物传感器技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究,并获得了较快的进展,如Divies首先提出用固定化细胞与氧电极配合,组成对醇类进行检测所谓“微生物电极”。1977年,钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告,并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面,作了详细报导,正式提出了对生物传感器的命名。,2.3.3 生物传感器分类,（1）根据传感器输出信号的产生方式,可分为生物亲合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器;（2

5、）根据生物传感器的信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等（3）根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。,生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有生物亲合作用，即二者能特异地相结合，同时引起敏感材料的分子结构和/或固定介质发生变化。例如：电荷、温度、光学性质等的变化。反应式可表示为：S（底物）+R（受体）=SR,代谢型传感器 底物（被测物）与分子识别元件上的敏感物质相作用并生成产物，信号转换器将底物的消耗或产物的增加转变为输

6、出信号，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为 S（底物）R（受体）=SR P（生成物）,上面介绍的各种名称都是类别的名称，每一类又都包含许多种具体的生物传感器例如，仅酶电极一类，根据所用酶的不同就有几十种，如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸电极、丙酮酸电极等等就是葡萄糖电极也并非只有一种，有用pH电极或碘离子电极作为转换器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极等实际上还可再细分。,2.3.4 生物传感器优点,(1)根据生物反应的特异性和多样性,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器,因而测定范围广泛(2)一般不需进行样品的预处理,它利

7、用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速,容易实现自动分析(3)体积小、响应快、样品用量少,可以实现连续在位检测,(4)通常其敏感材料是固定化生物元件,可反复多次使用(5)准确度高,一般相对误差可达到1%以内(6)可进行活体分析(7)传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪,因而便于推广普及(8)有的微生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生，能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息,2.3.5 生物传感器组成部分,生物分子识别元件(感受器)：是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞

8、、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等);信号转换器(换能器)：主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等,从而达到分析检测的目的。,a 生物传感器的信号转换器,生物传感器中的信号转换器是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可用信号的装置生物传感器的信号转换器已有许多种，其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电化学电极，用它组成的生物传感器称为电化学生物传感器可用作生物传感器的信号转换器的

9、电化学电极，一般可以分为两种类型。电位型电极和电流型电极,电位型电极,1离子选择电极 离子选择性电极是一类对特定的离子呈选择性响应的电极，具有快速、灵敏、可靠、价廉等优点，因此应用范围很广离子选择性电极作为生物传感器的信号转换器只是它的一种应用，在生物医学领域也常直接用它测定体液中的一些成分（如H+，K+，Na+，Ca2+等）。2氧化还原电极氧化还原电极是不同于离子选择电极的另一类电位型电极这里指的主要是零类电极。,电流型电极,电化学生物传感器中采用电流型电极为信号转换器的趋势日益增加，这是因为这类电极和电位型电极相比有以下优点：（1）电极的输出直接和被测物的浓度呈线性关系，不像电位型电极那样

10、和被测物浓度的对数呈线性关系（2）电极输出值的读数误差所对应的待测物浓度的相对误差比电位型电极的小（3）电极的灵敏度比电位型电极的高,氧电极,有不少酶特别是各种氧化酶和加氧酶在催化底物反应时要用溶解氧为辅助试剂，反应中所消耗的氧量就用氧电极来测定此外，在微生物电极、免疫电极等生物传感器中也常用氧电极作为信号转换器，因此氧电极在生物传感器中用得很广。目前用得最多的氧电极是电解式的Clark氧电极，Clark氧电极是由铂阴极、Ag/AgCl阳极、KCl电解质和透气膜所构成。当将氧电极插入含有溶解氧的溶液后，溶液中的O2将扩散，透过透气膜到达铂阴极表面被还原，还原电流值与溶解氧的量有关,b 敏感器件

11、（分子识别元件）,(1)酶传感器(Enzyme Sensor),它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质。例如,脲在尿素酶催化下发生反应1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极；此后,这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。,葡萄糖电极缺点:(1)溶解氧的变化可能引起电极响应的波动;(2)由于氧的溶解度有限,当溶解氧贫乏时,响应电流明显下降而影响检测限;(3)传感器响应性能受溶液pH值和温度影响较大,第二代生物传感器,即介体型生物传感器,常用媒介体有铁氰化物、有

12、机染料、醌及其衍生物、导电有机盐类和二茂铁及其衍生物。最近,人们更关注酶与电极之间的直接电子传递研究,并用于构造第三代生物传感器依据信号转换器的类型,酶传感器大致可分为酶电极(主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极)、酶场效应晶体管传感器(FET-酶)和酶热敏电阻传感器等,(2)组织传感器(Tissue Sensor),组织传感器是以动植物组织薄片中的生物催化层与基础敏感膜电极结合而成,该催化层以酶为基础,基本原理与酶传感器相同.与酶传感器比较，组织传感器具有如下优点：1.酶活性较离析酶高.2.酶的稳定性增大.3.材料易于获得.,肝组织电极 动物肝组织中含有丰富的H2O2酶，

13、可与氧电极组成测定H2O2及其它过氧化物的组织电极1981年Mascini等研究了数种哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）的肝组织电极，翌年，报道了基于牛肝组织的H2O2电极,牛肝-H2O2电极 取0.1mm厚牛肝一片，覆盖于氧电极的特氟隆膜上，用“O”型橡皮圈固定，即成牛肝组织电极 在pH6.80的缓冲液中，使电极与空气中的氧平衡，然后加入底物，底物为浓度大于1O-5molL H2O2溶液反应产生的氧气到达氧电极的特氟隆膜时，使电极输出增加在110-4mol/L底物浓度时，1.5min即可获得稳定电流，如图所示：,若向溶液中通以氮气，以降低氧的溶解度，减少空气平衡溶液中氧的残余电流（约10A）至

14、十分之几微安，检测下限可降低至1X10-5molL，相关系数 R=0.997(n9),植物组织膜电极结构图解 a一木瓜,b一果皮,c-中果皮,d-内果皮1-中果皮组织薄片2-固定化骨架3-透气健,4-垫圈5-内电解质6-复合PH电极7-塑料电极体3-7为二氧化碳气敏电极结构,(3)微生物传感器(Microorganism Sensor),微生物传感器分为两类：一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。好氧微生物在繁殖时需消耗大量的氧,可以氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。,呼吸机能(O2的消耗)型工作原理图,代谢机能型微生物传感器工作原理图,装

15、置是：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理是：利用微生物的同化作用耗氧,通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量,从而达到测量底物浓度的目的.,例如,荧光假单胞菌,能同化葡萄糖；芸苔丝孢酵母可同化乙醇,因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时,均消耗溶液中的氧,因此可用氧电极来测定基于不同类型的信号转换器,常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，,(4)免疫传感器(Immuno sensor),免疫传感器的基本原理是免疫反应。利用抗体能识别抗原并与抗原结合的功能的生物传感器称为免疫传感器。它利用固定化抗体(或抗原)膜与相应的抗原(或

16、抗体)的特异反应，此反应的结果使生物敏感膜的电位发生变化。,一、免疫传感器的基本原理,二、免疫传感器的结构及工作过程,在2、3两室间有固定化抗原膜，而1、3两室之间没有固定化原膜。在l、2室内注入0.9%的生理盐水，当在3室内倒入食盐水时,1、2室内电极间无电位差。,若3室内注入含有抗体的盐水时，由于抗体和固定化抗原膜上的抗原相结合，使膜表面吸附了特异的抗体，而抗体是有电荷的蛋白质，从而使抗原固定化膜带电状态发生变化，于是醋酸纤维膜抗原固定化膜1、2室内的电极间有电位差产生。,抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功能,在与抗原结合时,选择性强,灵敏度高，免疫传感器就是利用其双重功能将抗体或抗原

17、和换能器组合而成的装置。由于蛋白质分子(抗体或抗原)携带有大量电荷、发色基团等,当抗原抗体结合时,会产生电学、化学、光学等变化,通过适当的传感器可检测这些参数,从而构成不同的免疫传感器，总的来说可分为两类:(1)非标记型;(2)标记型,如黄曲霉毒素传感器,它由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成,加到待测样品中,酶标记的及未标记的黄曲霉毒素便会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应,测定酶标黄曲霉毒素与抗体的结合率,便可知样品中的含量根据使用的信号转换器,有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器及表面等离子体共振(SPR)型传感器。,(5)核酸传感器(The Sensor of Nucleic

18、Acid),依据生物体内核苷酸顺序相对稳定,核苷酸碱基顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器,即基因传感器。基因传感器一般有1030个核苷酸的单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。根据换能器种类不同可分为电化学型、光学型、压电免疫传感器及表面等离子体共振型基因传感器，这种传感器可用于检测食品中的病原体,为食品中病原体的鉴定提供了新的手段。,2.3.6 生物传感器的应用,在发酵工业中的应用在食品分析中的应用在环境监测中的应用在生物医学上的应用在军事上的应用,(1)在发酵工业中的应用,(2)在食品分析的应用,食品成分分析食品添加剂的分析农药和抗生素残留量分析微生物

19、和生物毒素的检验食品鲜度的检测,水质分析：测定生化需氧量（BOD），传统方法测BOD需5天，且操作复杂。1977年Karube等首次报道了BOD微生物传感器，只需15分钟即能测出结果,连续使用寿命达17天；废气或环境大气的监测：可用于测定空气中SO2、NOX、CO2、NH3、CH4等的含量；农药和抗生素残留量的分析：用乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶为敏感材料制作的离子敏场效应晶体管酶传感器可用于蔬菜等样品中有机磷农药DDVP和伏杀磷等的测定,(3)在环境监测中的应用,基础研究：生物传感器可实时监测生物大分子之间的相互作用。借助于这一技术动态观察抗原、抗体之间结合与解离的平衡关系，可较为准确地测定抗

20、体的亲和力及识别抗原表位，帮助人们了解单克隆抗体特性，有目的地筛选各种具有最佳应用潜力的单克隆抗体。临床应用：用酶、免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提出依据。生物医药：利用生物工程技术生产药物时，将生物传感器用于生化反应的监视，可以迅速地获取各种数据，有效地加强生物工程产品的质量管理。,(4)在生物医学上的应用,由于具有高度特异性、灵敏性和能快速地探测化学战剂和生物战剂（包括病毒、细菌和毒素等）的特性，生物传感器将是最重要的一类化学战剂和生物战剂侦检器材。如烟碱乙酰胆碱受体生物传感器和某种麻醉剂受体生物传感器能在10s内侦检出10-9浓度级的生化战剂，包括委内瑞拉马脑炎病毒、黄热病毒、炭疽杆菌、流感病毒等。,(5)在军事上的应用,2.3.7 流动注射式分析系统,11高压液相分析系统（HPLC）利用HPLC在线测量物质浓度，并配有发酵出口气体CO2分析仪和pH与氧化还原电极的发酵系统。产物的浓度，如木糖、乙醇和有机酸等，通过对发酵液采样过滤后进入过滤取样模件FAM（Filter Acquisition Module），再由HPLC系统进行分析。,思考与练习,叙述溶解氧的测定方法和原理。简述KLa的测定方法和原理谈谈生物传感器的作用。叙述酶、微生物分子传感器的工作原理。,