流式细胞仪分析技术及应用.doc

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1、第二十二章流式细胞仪分析技术及应用本章要点1.流式细胞仪的分析及分选原理2.数据的显示与分析3.流式细胞仪免疫分析的技术要求4.流式细胞术在免疫学检查中的应用概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。第一节流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光

2、源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。一、工作原理（一）基本组成结构1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10ms。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离

3、子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到

4、细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长，为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。3.光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合

5、适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过

6、放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差12 个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。4.计算机和分析系统:经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和

7、光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的68个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析。最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。（二）基本工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的

8、包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过AD转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，

9、将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360度立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向

10、也有关。流式细胞仪中涉及的散射光信号分为前向散射光和侧向散射光。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。（1）前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。（2）侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90度方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 三、荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不相同。每种荧光染料都有特定的激发波长，

11、激发后又会产生特定波长荧光和颜色，例如绿色、红色、黄色等。当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置光源的波长，目前台式机FCM常配置的激光器为488nm通常可用染料有PI、PE、FITC、PerCP、CY5等。四、细胞分选原理细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的

12、。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。分选指标主要包括：分选速度、分选纯度、分选收获率及分选得率。1.分选速度：指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式机的分选速度为300个秒，大型机的最高分选速度可达每秒上万个细胞。2.分选纯度：指被分选出细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%左右。3.分选收获率：指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。

13、通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队，而是随机的，因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同条件下，仪器会作出取或舍的决定，因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。4.分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得到目的细胞的实际得率。该得率与分选得速度密切相关。第二节数据的显示与分析峰值脉冲信号：指的是脉冲的高度。面积脉冲信号：指的是电压脉冲曲线内区域的大小。一、参 数流式细胞仪的数据参数是指仪器采集的用于分析的信号，包括：前向散射光：反映颗粒的大小。侧向散射光：

14、反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据仪器的不同配置，同一颗粒上可以同时检测多种荧光信号。二、数据显示方式流式细胞仪的数据显示方式有如下几种：（一）单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度。用“信道”来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。（二）双参数直方图双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形。常见有以下三种：1.二维

15、点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。2.二维等高图：类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化

16、率越大，等高线越疏则表示变化平衡。3.假三维图：是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。（三）三参数直方图目前，由于计算机软件的发展，很多商品化的软件均提供三参数直方图功能，意指这一类直方图的三维坐标均为参数而非细胞数。这种立体图以点图为显示方式，同样可以作全方位旋转以便仔细观察。（四）流式细胞仪的多参数

17、分析当细胞标记了多色荧光在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射信号可以根据需要组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样本制备流式细胞仪测定的标本，不论是外周血细胞、培养细胞或组织来源细胞，首先要保证是单细胞悬液，对不同来源的细胞制备成单细胞悬液有不同的处理程序。（一）外周血淋巴细胞样品的制备血和骨髓：天然单细胞悬液。当有血凝块时，应用50m尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是否仍然存在。一般采取密度梯度离心法。（二）培养细胞的样品制备贴壁生长的单层细胞需要用蛋白酶消化后用机械法分离。（三）新鲜实体组织

18、单细胞悬液的制备一般采取机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法等方法。分离不仅是要获得最大产量的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性。大多数淋巴样组织可用轻柔的机械方法快速分离，并保持收获细胞的相对完整。某些组织由于细胞间连接紧密，需在机械分离的基础上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要确认酶的使用没有改变、减弱靶抗原的表达，细胞活性没有显著降低。（四）单细胞悬液的保存常用的处理方法有三种：1.深低温保存法。2.乙醇或甲醇保存法。3.甲醛或多聚甲醛固定法。二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色（一）免疫荧光标记最

19、常用的荧光染料最常用的染料有FITC和藻红蛋白类（PE）及罗丹明等。FITC（异硫氰酸荧光素）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色675nmPI（碘化丙啶）：橙红色620nm488nm波长的氩离子激光激发APC（别藻青蛋白）：红色660nm630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发（二）免疫荧光标记 常用的标记染色为直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色。在进行双参数或多参数分析时，常常需要进行荧光抗体的组合标记，目前已经有双色、三色以及四色标记。（三）细胞自发荧光自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫

20、细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。三、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制1.采用适当的制备方式。2.红细胞的处理。3.实体组织来源标本的单细胞悬液制备最好采用机械法。4.温度与pH。（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制1.温度对荧光染色的影响。2.pH对荧光发射强度的影响。3.荧光染料浓度的控制。4.固定剂对免疫荧光染色的影响。（三）仪器操作技术的

21、质量控制1.光路与流路校正。2.PMT校准。3.绝对计数的校准。（四）免疫检测的质量控制1.同型对照。2.全程质控。第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析。进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。（一）T淋巴细胞及亚群分析1.Th细胞。2.Tc细胞。（二）B淋巴细胞及亚群分析（三）NK细胞分析图 流式细胞术分析双色血液淋巴细胞免疫表型，根据前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）设门，分不同区域（R）R1为淋巴细胞，R2为单核细胞，R3为中性粒细胞。图 只分析

22、R1内的淋巴细胞，见散点图。上述两图引自王建中主编：实验诊断学，北京大学医学出版社，2004年第1版二、淋巴细胞功能分析（一）细胞介导细胞毒性试验（二）细胞内细胞因子测定三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型（从略）四、肿瘤耐药基因分析（从略）五、在AIDS病检测中的分析（从略）六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析（从略）第二十三章免疫自动化仪器分析本章考点：1.概述2.自动化免疫比浊分析技术3.化学发光自动免疫分析4.荧光免疫自动化分析免疫学是一门迅速发展的学科，免疫学理论和技术已广泛应用于临床医学和检验医学。免疫测定（IA）是指利用抗原和抗体特异性结合反应的特点来检测标本中微量物质的方法

23、。免疫测定的应用范围不仅是具有免疫原性的物质，而且遍及检验医学的各个领域。可测定的物质有许多，包括免疫球蛋白及其片段、单个补体成分、细胞因子及其受体、细胞粘附分子及其配体、微生物抗原成分及相应抗体、血液中多种凝血因子、酶及同工酶、小分子。各种自动化免疫分析仪在设计原理中都使用了新的免疫分析基本技术，如：酶免疫分析；生物素-亲和素技术；荧光免疫分析；化学发光技术等。自动化仪器设计中主要采用的技术指标有：检测用抗体必须具有高特异性和高亲和力；通常采用磁性微球作为固相载体。增加反应面积；常放大抗原抗体的反应信号的系统；结合计算机软件系统自动处理分析信号及数据转换；人工智能化的设计，自动检测及校对功能

24、。 第一节自动化免疫比浊分析技术20世纪70年代末期以来，Ritchic提出了用激光散射法来测定补体C3和触珠蛋白形成的抗原-抗体复合物，并将其称为散射比浊。1977年Stemberg提出了更快速的比浊法，称为速率散射比浊法。图 散射免疫浊度法及透射免疫浊度法示意图一、散射免疫比浊分析原理散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、

25、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。（一）散射颗粒与散射光悬浮在反应溶液中的分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心，当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多，则散射光的分布比较均匀，称为Rayleigh散射。如果颗粒直径接近于入射光的波长，则散射光的分布明显不均匀，称为Mile散射。（二）反应物含量与散射浊度抗原抗体结合反应中，遵守典型的Heidelberger曲线，即当抗体量恒定时，抗原与抗体结合，形成免疫复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。 二、定时散射比浊分析（一）基本原理定时散射比浊分析采用的是免疫沉淀反应与散射比浊分析相结合的技术。（二）抗原过量检测在本方法中采用

26、了两项保证措施。1.抗体过量。2.对抗原过量进行阈值限定。三、速率散射比浊分析（一）基本原理速率散射比浊分析是一种动力学测定方法，在一定条件下，抗原和相应的抗体很快结合成抗原抗体免疫复合物颗粒，速率比浊法就是在一定时间内抗原抗体结合过程中，测定二者结合的最大反应速度，即反应达顶峰峰值。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不同，通过电脑处理，求出抗原含量。（二）抗原过量

27、检测真正的抗原过量检测是为保证速率散射比浊分析检测的准确性和精确度，在Beckman公司的生产的ARRY360系统中，设计有抗原过量检测系统。其原理是根据抗原抗体反应形成的浊度不断增加而设计的。在抗体固定的情况下，免疫复合物的生成量随抗原的增加而增加，当抗原量超过抗体量时，免疫复合物的量反而减少。根据这一原理，当标本中的抗原和反应液中的抗体结合后，若反应液中有未结合的抗体存在，再加入抗原时，可见新的速率峰值信号。如果没有游离的抗体存在，即抗原过剩的情况下，就不会有或者只有很小的新的速率信号出现，仪器会重新对标本进行更高稀释（1：6、1：36、1：216及1：1296等），然后进行测定，使结果准

28、确可靠。附：终点散射比浊法其原理是让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前（大约反应数十分钟）进行浊度测定。敏感度达mgL水平，可自动化，但反应时间较长。四、免疫透射比浊分析透射比浊法的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量，当光线通过时，由于溶液中存在的抗原抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。（一）原理抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物（IC），当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少

29、，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。附：免疫胶乳比浊法原理：选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。该法敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEC沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪均可使用。（二）实验要求1.溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大，分

30、子太小则阻挡不了光线的通过。2.溶液中抗原抗体复合物的数量要足够多，如果数量太少，溶液浊度变化不大，对光通量的影响不大。3.透射比浊是依据溶液中颗粒形成或增加而使透射光减弱的原理来定量检测抗原，检测仍需抗原抗体反应的温育时问，检测时间较长。4.检测用抗体一般应选择高亲和力的抗体，在检测中要保证抗体过量。应制备标准曲线。五、免疫浊度分析的注意事项（一）校准程序（二）定标程序（三）自动控制（四）自动系统第二节化学发光自动化免疫分析一、化学发光免疫分析的原理化学发光免疫分析技术是将发光系统与免疫反应相结合，以检测抗原或抗体的方法。其既具有免疫反应的特异性，更兼有发光反应的高敏感性。一种物质由电子激发

31、态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物分子激发到电子激发态。当电子从激发态的最低振功能级回到基态的各个振动能级时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光。发光可分为三种类型：光照发光、生物发光和化学发光。二、化学发光免疫分析中的标记物质及类型化学发光免疫分析所使用的标记物可分为三类：1.发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记物；2.以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；3.以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。（一）直接参与发光反应的

32、标记物这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应，并没有本底发光。最常用的标记物主要有吖啶酯类化合物。吖啶酯类化合物发光是典型的瞬间发光，其化学发光分析时间很短，在加入氧化剂和pH纠正液后，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光，在1秒内光子散射达到高峰，整个过程在2秒内完成。（二）以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物在这类发光反应中，采用某些酶作为标记物。这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身直接参与发光反应。主要有两种酶：1.辣根过氧化物酶（HRP）2.碱性磷酸酶（ALP）（三）以能量传递参与氧化反应的非酶标记物这类标记

33、物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。最常用的有三联吡啶钌标记物。三、化学发光免疫分析的类型化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型：（一）化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒。（二）化学发光免疫测定化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方

34、法。吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：1.能参与化学发光反应。2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。（三）微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0m，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。其反应

35、基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。（四）电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLL的

36、测定模式与ELISA相似。其基本原理是发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。四、在临床免疫检测中的应用化学发光免疫测定具有明显的优越性：敏感度高，甚至超过RIA；精密度和准确性好，可与RIA相比；试剂稳定无毒害；测定耗时短；测定项目多；已发展成自动化测定系统，因此在医学检验中可取代RIA，应用十分广泛，如测定激素、肿瘤标志物、药物浓度、病毒标志物等。第三节荧光免疫自动化分析一、时

37、间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的

38、荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达l2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧

39、光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命lms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命l.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。如果Stakes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。镧系元素的荧光光谱有较大的Stakes位移，最大可达29

40、0nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计，由三大部分组成：光源：脉冲光源：氙灯（每秒闪烁l000次）；小型N2激光器；输出脉冲波长：337nm荧光信号获取系统；数据处理系统。（三）解离增强原理解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu

41、）连接，另一端与抗体抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。（四）TR-FIA应用1.激素：甲状腺激素、甾体类激素。2.病毒性肝炎标志物。3.肿瘤相关抗原。4.药物。5.多肽类。二、荧光偏振免疫测定在荧光偏振免疫测定（

42、FPIA）中，荧光素标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，反应后用单一平面偏振的光源照射，荧光素被激发产生偏振荧光。偏振荧光的强度与分子转动的速度成反比。标记抗原与抗体的复合物分子量大，旋转慢，偏振荧光强；游离标记抗原的分子量小，偏振荧光弱。因此不需进行B和F的分离即可进行测量。FPIA主要用于测定小分子药物浓度。三、荧光酶免疫分析荧光酶免疫分析是以碱性磷酸酶为标记用酶，以反应管作为固相载体，以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）为酶反应荧光基质。根据荧光计数仪记录荧光强度来计算所测物质的浓度。该法灵敏度达到或超过放免水平。可用于各种抗原抗体的检测。四、在临床免疫检测中的应用TR-FIA可

43、应用于多种物质的检测，例如：肿瘤标志物；激素；甲状腺激素；铁蛋白；HBsAg等。FPIA主要用于药物浓度的检测及分析，如叶酸、VB12、可卡因、利多卡因等。荧光酶免疫分析主要用于过敏原检测，以及特异性IgE检测，目前，在自动化仪器上，国外已开发了许多试剂，例如检测自身抗体和其他病原体的试剂。（102-104共用题干）A.鲁米诺B.吖啶酯C.三联吡啶钌D.HRPE.罗丹明习题102 电化学发光测定的底物是答疑编号500734230101正确答案C习题103 化学发光免疫测定的底物是答疑编号500734230102正确答案B习题104 化学发光酶免疫测定的底物是答疑编号500734230103正确答案A