第五章 DNA的生物合成课件.ppt

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1、中心法则（the central dogma),DNA,RNA,Protein,1958 F.Crick 1970 H.Temin(逆转录),Chapter 5 DNA replication,复 制 概 念,遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上，称为复制，这是生物体内高分 子的聚合过程，即DNA的生物合成。,第一节 DNA复制的基本方式,一、半保留复制（semiconservative replication),复制时母链的双链DNA解开成各自作为模板指导子代合成互补链；子代的两条链：亲代链新合成链；由于碱基互补，子代DNA双链和亲代DNA碱基序列一致。,通过半保留复制，子代DNA和亲

2、代的DNA是一致的,重新合成的子代链,母链,意 义,子代保留了亲代DNA的全部信息；DNA通过复制和基因表达决定生物特性；体现了遗传过程的相对保守性；保守性是相对的，不能忽视其变异性。,复制叉移动方向,前导链,冈崎片段,后随链,二、半不连续性（semidiscontimity）,不连续复制,连续复制,半不连续复制：在生物中普遍存在的这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制方式，称为DNA合成的半不连续性。,概念,复制叉、前导链、后随链、冈崎片段,第二节 DNA复制的酶学,复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与。,dNTP,DNA-pol,单链的DNA母链,RNA引物,其它

3、辅助因子,dTTPdATPdCTP,复制过程中的脱氧核苷酸聚合,代表引物,C,DNA聚合酶（DNA polymerase）DNA螺旋酶 拓扑酶 引物酶 连接酶 其它相关酶和蛋白质,一、DNA聚合酶（DNApolymerase）,原核生物：DNA-pol I II III 真核生物：DNA-pol,原核生物DNA聚合酶,DNA聚合酶活性,DNA-pol I（103kDa）,结构特点1、由18个-螺旋区组成；2、蛋白酶水解产生2个片段：小片段：有53外切酶活性大片段：有DNA聚合酶活性及3 5外切酶活性。,Kornberg酶,1956,主要作用：,填补复制修复空隙(53外切酶活性),校正复制中错误

4、(35外切酶活性),一条分子量120kDa的多肽链活性很低能促进DNA合成有35的外切核酸酶活性，无53外切酶活性 在DNA的修复中起一定作用,DNA-pol II,Kornberg,Gefter,19701971,真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶（Replicase）；10种亚基组成的不对称二聚体；核心酶(core enzyme)：具有核苷酸聚合的作用；35外切酶活性。,DNA-pol III,Kornberg,Gefter,19701971,E.coli DNA 聚合酶不对称二聚体,核心酶(,),原核生物DNA聚合酶的比较,酶活性 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 分子大小（

5、kd）250 36-38 163-300 170 256细胞内定位 核 核 线粒体 核 核功能 引物酶活性 修复 复制 主要 校读、修 复制（无其它 聚合酶 复、填补 DNA-pol时）,真核生物的DNA聚合酶,DNA解旋酶/DNA解旋蛋白（DNA unwinding protein）：催化双螺旋DNA的解旋和解链，该过程需水解ATP提供能量。,二、DNA解旋酶（DNA helicase）,解旋酶和rep蛋白；解旋酶：沿着后随链的模板，从53方向移动，促使复制叉向前延伸；rep蛋白：沿着前导链的模板，以35方向向前移动，从而促进双链不断解开。,三、DNA拓扑异构酶（DNA Topisomera

6、se）,原核和真核生物中都发现二类拓扑异构酶：Topo和Topo 原核生物：Topo与复制有关 Topo与转录有关真核生物：Topo和均与复制有关。作用：通过切断、旋转和再连接作用，理顺DNA链。,DNA结合蛋白对单链DNA有高亲和力，能特异地结合到分开的单链DNA上。对DNA复制区形成的单链DNA有稳定作用。在真核生物中，一种单链DNA结合蛋白称之复制蛋白A（replication protein A,RPA）结合到暴露的单链上。,三、单链DNA结合蛋白(single-strand DNA binding protein,SSB),解开、理顺DNA链、维持DNA单链状态,四、DNA引物酶(P

7、rimase),引物酶：复制是在一段RNA引物上加入脱氧核苷酸，而催化引物合成的RNA聚合酶。,目的：尽量减少DNA复制起始处的突变。,五、DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶：催化冈崎片段间磷酸二酯键的形成；注意：连接碱基互补基础上双链中的单链缺口，不能连接单独存在的DNA或RNA单链。,连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口,解螺旋酶：解开DNA双螺旋DNA拓朴异构酶：理顺DNA链单链DNA结合蛋白：稳定维持DNA单链状态前导链的合成：在聚合酶III与滑动夹子结合下连续合成。尾随链的合成：解旋酶（DnaB）和引物酶（DnaG）沿着模板移动。每1000-2000bp合成一个引物。

8、聚合酶III延伸引物，一直达到前一个冈崎片段为止。聚合酶I去除RNA引物，并填补留下的空隙。连接酶封闭最后缺口。,各种酶与蛋白质的作用小结,第三节 DNA生物合成过程,DNA复制的基本过程,起始 延长 终止,大肠杆菌DNA复制的相关酶和蛋白质,（一）复制的起始(initiation),一、原核生物的 DNA 生物合成,引发体生成,引物合成,DNA 解链,DnaA蛋白、rep蛋白、SSB 和 拓扑酶共同参与。起始点（ori C）固定单一起始点 跨度 254 bp 结构：3 组串联重复序列（识别区）2 对反向重复序列（富含AT）,1、DNA 解链,Dna B,Dna C,Dna A,SSB,DNA

9、,大肠杆菌起始点:DNA-蛋白质复合物的类核小体结构,DNA 解链的基本过程,在解链基础上，引物酶进入形成引发体。引发体 为含解螺旋酶、引物酶和DNA复制起始区的复合物。,2、引发体形成：,3、引物的生成：,引发体移动过程中，在适当位置引物酶催化引物生成。,复制的起始(initiation),复制方向（5 3）半不连续复制冈崎片段前导链滞后链,（二）复制的延长(elongation),引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol I）连接（连接酶）,（三）复制的终止(termination),终止点（Ter）：,基本过程,二、真核生物的DNA生物合成（一）复制的起始（比较原核生物）1、过程同原核生

10、物：解链 引发体形成 生成引物 2、特点：起始点结构较 ori C 短（酵母为11bp，富含AT，称为自主复制序列 autonomouse replication sequence，ARS）多起点（多复制子）时序性（分组激活，非同步进行）,3、参与酶和蛋白因子：DNA-pol（引物酶活性）DNA-pol（解螺旋酶活性）拓扑异构酶 复制因子（RF，如：RFA、RFC）增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）4、通过细胞周期实现其调节：细胞周期与DNA复制 细胞周期蛋白、周期蛋白依赖激酶与细胞周期 CDK抑制物 锚蛋白（ankynin）、P2

11、1蛋白,1、DNA-pol 催化合成引物。2、DNA-pol 在增殖细胞核抗原（PCNA）协同下，催化领头链或随从链合成（DNA-pol 与 发生转换）。3、引物除有RNA外，还有DNA片段参与构成（去除引物不仅需要RNA酶，还需要核酸外切酶）。4、引物和冈崎片段都较原核短（引物长度大致与核小体所含DNA长度或其若干倍）。5、合成速度较慢，但总速度不慢。,（二）复制延长,35,35,53,真核生物复制叉的延长,注：当随从链延长了一个或若干个核小体的长度后，要重新合成引物,（三）复制终止和端粒酶 复制与核小体装配同步进行,引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol）连接（连接酶）,1、基本过程,端

12、粒的复制模型,1989年Greider和Blackburn提出了端粒的复制模型。反应为四步进行：（1）首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶 中的RNA与凸出的3模板配对；（2）以RNA为模板，在DNA3端上从头合成 DNA；（3）延伸六个nt；（4）合成一个重复单位后，端粒酶向DNA模板 新合成的3移动，RNA再和模板配对，就这样循环 往复，周而复始。最后延伸的3端再回折，以GG 配对的方式形成发夹结构，产生端粒。,癌症与端粒酶,此前人们已经发现，癌细胞往往会产生格外多的端粒酶，使它们能不断分裂繁殖。认为80%的癌症与端粒酶过多密切相关。英国自然细胞生物学杂志最近在网上提前发表了美国加利福尼亚

13、大学伯克利分校的科学家的报告。科学家用会发出荧光的蛋白质给端粒酶“染色”，观察它们在细胞里的活动。结果发现，正常细胞是将端粒酶限制在细胞核里的一个特定区域，只有在细胞分裂、DNA端粒需要修补时才把它释放出来。与之相反，在癌细胞里，端粒酶有很大的自由度。科学家认为，端粒酶在癌细胞里能够自由活动，可能与癌细胞的强大生命力有关。如果找到方法把这些端粒酶重新“关起来”，就有可能抑制癌细胞的繁殖。,第四节 其他复制方式,一、逆转录:RNA DNA,二、滚动复制和 D环复制滚动复制 某些低等生物的复制方式；复制不需要引物。D环复制 线粒体 DNA 复制方式。,OH 3P 5,X174（单链DNA）病毒感染

14、型,蛋白A（具核酸内切酶活性）,5,3,5,3,滚动复制示意图,双链DNA,DNA-pol dNTP,D 环复制在进行中,第一个复制起始点引物以内环为模板,A 延伸至第二个复制起始点时，合成反向引物，以外环为模板,A,起始点 多 点 单 点速度 慢（原核的1/10）快引物大小 短（约10个核苷酸）长（约数十个核苷酸）冈奇片段 少（约100200 多（约10002000 个核苷酸）个核苷酸）酶 DNA聚合酶-DNA聚合酶 III端粒酶 有 无,真核与原核生物复制的主要区别,DNA replication:semiconservative,semidiscontimity Enzymes and proteins of DNA replication:DNApolymerase,DNA helicase,DNA Topisomerase,SSB,Primase,DNA ligase,et al.Replication of prokaryote and eukaryote,Summary:,Please detail the replication process of eukaryote.,Question:,