第十二章 09 DNA的生物合成课件.ppt

《第十二章 09 DNA的生物合成课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十二章 09 DNA的生物合成课件.ppt（86页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第十三章 DNA的生物合成,本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。要求同学们掌握：1.参与DNA复制的主要酶类和蛋白质因子;2.DNA的复制过程;3.反转录合成DNA。,遗传信息传递的中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲

2、代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,目 录,第一节 DNA的复制第二节 逆转录作用第三节 DNA的损伤与修复第四节 DNA突变,第一节 DNA的半保留复制,一、概念和实验依据二、DNA聚合反应有关的酶类及条件三、DNA复制的特点四、原核细

3、胞DNA的复制过程五、DNA复制的忠实性六、真核细胞DNA的复制,DNA的半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,15N DNA,14N-15N DNA,14N DNA,14N-15N DNA,出现

4、上述三条带结果与半保留复制模式假设是完全符合的。,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验),将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。,二、DNA聚合反应有关的酶类及条件,底物模板拓扑异构酶解旋酶,单链DNA结合蛋白引发酶DNA聚合酶

5、DNA连接酶,DNA复制以四种脱氧核糖核苷酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,（一）底物,聚合反应机理,PPi,DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,（二）模板,拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。在复制时，随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。有和两种类型,（三）拓扑异构酶（topoisomerase）,拓扑异构酶是一类可改

6、变DNA拓扑性质的酶。在复制时，随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。有和两种类型,首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶来完成，但它对正超螺旋无作用。,型拓扑异构酶,由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。,

7、型拓扑异构酶,DNA解旋酶(helicase)（解链酶）功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP，作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一种沿模板5-3 方向移动，rep蛋白沿模板3-5方向移动。,要将DNA双链解开，主要依赖于DNA解旋酶（也称为解链酶），还需要参与起始反应的多种蛋白因子，如DnaA。DnaA能够识别大肠杆菌复制原点OriC富含A/T的3个13个bp的重复序列区，使双链DNA连续变性，启动解链过程。,单链DNA结合蛋白（single strand bindi

8、ng protein,SSB）又称螺旋降稳蛋白（HDP）。能够与单链DNA结合的蛋白质因子，其作用为：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；防止DNA链重新结合。保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,（五）单链DNA结合蛋白,分子量约为60kDa的单肽链，每个细胞约有50-100个分子，该酶单独存在时活性低，只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，这种复合体称为引发体（primosome）。,（六）引发酶,引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3

9、-OH，使子代DNA链能够开始聚合。合成的引物是长约5-100个核苷酸的RNA。一旦RNA引物合成，就可以由DNA聚合酶在它的3-OH上继续催化DNA新链的合成。,DNA聚合酶是以DNA为模板，催化底物（dNTP）合成DNA的酶类，普遍存在于生物体内。它们的作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物，在DNA模板指导下，催化底物加到引物的3-OH上，形成3，5磷酸二酯键，由53方向延长DNA链。引物是DNA合成所必需的。,（七）DNA聚合酶,在大肠杆菌中，目前发现的DNA聚合酶（DNA polymerase）有三种：DNA聚合酶（pol）DNA聚合酶（pol）DNA聚合酶（p

10、ol）这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol 和pol。,大肠杆菌DNA聚合酶由一条分子量为101kDa的单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。每个大肠杆菌细胞约有400个分子的DNA聚合酶。Arthur Kornberg于1957年分离出来，因此获得1959年的诺贝尔奖。分离工作十分艰巨，用了100kg细菌分离到500mg的纯酶（polymerase），或称Kornberg酶。它是一个多功能酶。,DNA聚合酶,DNA聚合酶的功能如下：53聚合酶活性，即当底物和模板存在时，DNA聚合酶可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的3-OH末端的多核苷酸链上，在37条件下，每分

11、子DNA聚合酶每分钟可以催化大约1000个脱氧核苷酸的聚合；53外切酶活性，它可以及时切除复制起始合成的RNA引物；35外切酶活性，起校对功能，它可以切除聚合上去的错误的核苷酸，从而可使复制的忠实性提高1000倍。,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,3,5,模板链,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,DNA聚合酶的校对作用,DNA聚合酶,DNA聚合酶为多亚基酶，由分子量约为88kDa的多肽链组成，其活力比DNA聚合酶高，每分钟可催化约2400个核苷酸的聚合，每个大肠杆菌细胞约含有100个分子的DN

12、A聚合酶。功能：53聚合酶活性 35核酸外切酶活性 但无53外切酶活性。它也只是修复酶，而非真正的复制酶。,DNA聚合酶,DNA聚合酶被认为是真正的DNA复制酶(replicase)，全酶由、等10种亚基组成，也含有锌原子，分子量大约900kDa，以二聚体起作用。亚基主要有53聚合活性，亚基具有35核酸外切酶活性，2个亚基充当“滑动夹子”，它通过复合物夹子载体组装到DNA上。2个亚基围绕双螺旋形成一个环，以利于聚合酶沿着模板滑动。,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,DNA聚合酶：强催化活性、忠实性、持续性。D

13、NA聚合酶可连续催化几千个磷酸二酯键的形成。所以它催化的合成速度达到了体内DNA合成的速度。它还有35核酸外切酶活性，使得复制的忠实性由710-6提高至510-9，但DNA聚合酶无53外切活性。,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率,DNA聚合酶,109，000400+1,120，000100+-0.05,400，00010-20+-50,比较项目,DNA聚合酶,切除引物修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）,DNA连接

14、酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，使两段DNA连接起来。DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,（八）DNA连接酶,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5

15、,5,5,3,3,模板链,模板链,三、DNA复制的特点,复制起始点 复制终止点需要引物复制的方向性半不连续复制,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序（特定的位点）的片段，即复制起始点（复制原点 ori）。在DNA复制时，两条亲代链在复制起点处部分分开，此时形成一种动态的Y字型结构，称之复制叉，即复制正在发生的部位，同时进行着解链和合成。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。,1.复制起始点,在环形DNA中，整个结构象字母,在电镜下观察犹如一只眼睛，称为复制眼。对于环状DNA，复制眼使其成为结构。,真核生物染色体DNA复制方式 多复制子复制，即

16、DNA上先形成多个复制眼，双向复制。“眼”扩大互相相连，形成“大眼睛”最后完成整个DNA的复制，形成两个DNA分子。,原核生物复制起始点的结构,E.coli的复制起点Ori大约长245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。,9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dn

17、aA蛋白是起始的关键成分。,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,2.复制终止点,在复制子的末端，由一段特殊的序列，称为复制的终止位点（ter），完成复制的终止。在环型E.coli的染色体双向复制中，复制的终止位点是在两个复制叉的会合处。由一个复制起始点进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制，即复制单位。DNA复制单位亦称为复制子（重点概念）。,一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。,3.需要引物,参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有

18、3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为510个核苷酸，RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,DNA,RNA引物,A,U,T,OH,5 5,每一DNA片段都有自己的RNA的引物,复制正在发生的位点（复制叉）,3,5 3,A,单向复制：即只形成一个复制叉（replication fork）双向复制：即形成两个复制叉。如E.coliDNA等。,2.都是53方向合成,1.单向复制,也可以是双向复制,4.复制的方向性,DNA的双向和单向复制,5.半不连续复制,复制过程中，催化DNA合成的DNA聚合酶只能催

19、化核苷酸从53方向合成，以3 5链为模板时，新生的DNA以53方向连续合成；而以53为模板只能合成若干反向互补的冈崎片段，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续复制。,日本科学家Okazaki（冈崎）认为复制时复制叉向前移动，留下两条单链分别做模板，一条是35方向，以它为模板合成的新链是53方向，是连续的，称为前导链（leading strand）；而另一条模板链是53方向，以它为模板，合成的新链是不连续的DNA片段，称作冈崎片段（Okazaki fragment）。由多个冈崎片段连接而成的这条新的子代链，称为滞后链(lagging strand)。,前导链和随后链,随后链,前导链,冈崎片段

20、,复制叉前进的方向,在一个复制叉内，两条新链的合成都是53方向。,四、原核细胞DNA的复制过程,复制的起始复制的延伸复制的终止,1.DNA双螺旋的解开(1)在大肠杆菌中，解链酶在复制叉内解开亲代双螺旋;(2)分开的双链再和SSB结合，防止链内退火重新复性成为双链，使局部解开的两条单链可以作为复制模板。,（一）复制的起始,(3)拓扑异构酶II作用 不论线状或环状DNA分子，局部解链会导致超螺旋应力的增加，阻碍解链的前进。因此必须放出超螺旋应力。在大肠杆菌中是由拓扑异构酶II，即旋转酶切开环状超螺旋的两股，释放出超螺旋应力，而后再封口，除去环状DNA分子中的超螺旋。,2.RNA引物的合成 在合成D

21、NA链之前必须有一种引物。引物就是在DNA模板链上装配的一小段互补RNA，而末端有一个游离的3-OH。DNA聚合酶只能把底物（dNTP）转移到引物游离的3-OH上去。,（二）复制的延伸,1.半不连续复制(semicontinuous replication),（1）DNA酶作用（2）在引物上加入底物 dNTP（3）方向 5 3（4）半不连续性复制,先导链与后随链的矛盾如何解决？,根据计算，每一复制叉仅含1个DNA聚合酶全酶，这说明前导链和随后链上的DNA合成是由同一复制体负责的。但DNA两股链上的DNA合成不是同步进行的，并且方向相反，那么复制体是怎样工作的呢？为此提出了模型认为：当前导链上开

22、始DNA合成和复制叉向前移动时，随后链即向后回折成环。,回环模型,（三）复制的终止,在单方向复制的环状分子中，复制的终点就是它的复制原点，在双方向复制的环状分子中，大多数是两个生长点的简单碰撞。1.去除引物，填补缺口 2.连接冈崎片段,大肠杆菌染色体复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,1.去除引物，填补缺口,在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延

23、长。,2.连接冈崎片段,在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,五、复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下几点:,DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7 10-6）,DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）,起始时以RNA作为引物,聚合时的方向,修复作用,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配碱基,复制

24、方向,正 确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,起始时以RNA作为引物的作用,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,聚合时的方向 现在已知DNA的聚合都是53，为什么不能从3

25、5端聚合呢？原来，如果按53聚合，一旦出现碱基错配，可由DNA聚合酶从3端切除聚合上的错误的核苷酸，剩下3-羟基，后者可以接受由以dNTP为原料而生成的单核苷酸，即dNTP可以和上一个核苷酸的游离3-羟基生成3，5-磷酸二酯键，dNTP自身水解掉焦磷酸。,真核细胞DNA复制的特点,多个起点复制,真核生物的DNA聚合酶 端粒（telemere）复制,真核生物的DNA聚合酶,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了

26、澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,端粒合成的一种模型,整合和杂交,真核和原核DNA细胞复制比较,第三节 DNA的损伤与修复,某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤.DNA

27、的修复主要有以下类型:,暗修复,四、诱导修复（SOS修复）,一、光裂合酶修复,二、切除修复,三、重组修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制

28、，以SOS借喻细胞处于危急状态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,SOS修复,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),第四节 DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的

29、遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog)碱基修饰剂(base modifier)嵌入染料(intercalation dye)紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation),一、突变的类型 碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshift mutation),DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshift mutation),第二节 逆转录作用,一、概念,二、逆转录酶,三、逆转录的生物学意义,扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶,三种功能,逆转录过程中cDNA的合成,逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,