生物化学之DNA的生物合成课件.ppt

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1、第三篇 基因信息的传递,第 十 章 DNA的生物合成（复制）第十一章 转录第十二章 翻译第十三章 基因表达调控,中心法则,基因：是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA,第十章 DNA的生物合成（复制）,复制的要点 1 半保留复制2 有起始点、终止点和方向3 半不连续复制,第一节 半保留复制,半保留复制：当细胞分裂,DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的旧链。另一股单链完全重新合成的新链，且按碱基配对原则与旧链互补。,1、Watson和Crick的半保留复制模型：DNA双螺

2、旋的两条链碱基通过A-T、G-C之间的氢键联结，并且两条链互补。因此，Watson和Crick提出DNA的半保留复制模型：双螺旋揭开，每条链作为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，在依赖于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配对方式，合成与两条模板链脱氧核苷酸对应的两条新链，然后以一新一旧脱氧多核苷酸组成的双链分别进入子细胞。,2、模型的试验证明：1958年Meselson和Stahl用密度梯度离心法结合同位素标记法进行证明试验：（1）将大肠杆菌在含标记的15NH4Cl的培养基内，繁殖12代，保证DNA上的N都是15N；（2）将上述培养好的细菌转入到含14NH4Cl的培养基

3、中继续培养，并在细菌刚转入14NH4Cl中（0代）以及在此培养基中分裂1、2、3、4代时分别取样分析；,第二节 DNA复制的酶学,1.底物：dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶：DNA聚合酶（DNA依赖的DNA 聚合酶)DNA-pol3.模板：单链的DNA母链4.引物：寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子：解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶,DNA聚合酶的活性,5至3的聚合活性5 3方向核酸 外切酶活性5 3外切酶活性3 5外切酶活性,一、聚合酶催化的反应,5至3的聚合活性（5 3）,核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性,聚合反应在DNA聚合酶催化下

4、，四种脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）被加到DNA链的3末端，同时释放出无机焦磷酸。1、DNA链的游离3-羟基对进入的dNTP磷原子发生亲核攻击，形成3,5-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸2、形成磷酸二酯键的能量来自-与-磷酸基之间高能键的裂解3、聚合反应可逆，但随焦磷酸的水解可推动反应的完成4、DNA链由5向3方向延长5、需要有游离的3-羟基，即需要引物链,二、DAN聚合酶结构,(一)原核生物：pol：与校读，修复有关A、DNA聚合酶活力：通过核苷酸聚合反应使DNA链 沿53方向延长；B、35核酸外切酶活力：由3端水解DNA链。在 正常情况下该活力受抑制，一旦出现错配碱

5、基时，聚合反应停止，该活力会切去错配碱基，起校 对作用；C、53核酸外切酶活力：由5端水解DNA链。切 除嘧啶二聚体和RNA引物。小片段：5 3核酸 外切酶活性大片段（Klenow片段）：聚合活性、3 5外切活性（常用的工具酶）,pol：以带有缺口的双链DNA为模板和引物，从53方向合成DNA，同时具有35外切酶活力。可能在DNA的修复中起作用。,pol：真正起复制作用的酶。由10种亚基组成的不对称二聚体，、组成核心酶活性：聚合活性、3 5外切活性+pol（核心酶）pol（核心酶）+pol pol+pol*（全酶）具有聚合酶活力，具有校对功能，是组建核心酶因子，是二聚化因子，和是延长因子，识别

6、引物并引导聚合酶结合，复制起始时被释放。pol只作用于有缺口的双链DNA，pol可作用于有引物的长单链DNA，pol*是天然的聚合酶,（二）真核生物（DNA-pol）：DNA聚合酶：与随从链的合成有关。需要以缺口双链或带引物的单链DNA为模板，引物是DNA或RNA短链，RNA引物由引物合成酶合成DNA聚合酶：核酸外切酶活性，与修复有关DNA聚合酶：存在于线粒体。以RNA为模板，以DNA短链为引物DNA聚合酶：与领头链的合成有关。具有35外切酶活力DNA聚合酶：与校读、修复和填补缺口有关,核酸外切酶活性和即时校读DNA-pol，的3 5外切酶活性（主要应用在引物切除后的缺口复制）复制的保真性和碱

7、基选择pol 的亚基先形成氢键，再生成磷酸二酯键 依赖三种机理1 遵守严格的碱基互补配对规律2 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能3 复制中出错时有即时校读功能,（三）DNA聚合酶的核酸外切酶活性和复制的保真性,三、复制中解链和DNA分子的拓扑学变化,（一）解链酶 领头链 Dna B（解旋酶）随从链 解链酶,SSB：单链结合蛋白,（二）DNA拓扑异构酶（解旋酶）既能水解，又能连接磷酸二酯键 拓扑酶：切断DNA双链中的一股（原核生物中只能消除负超螺旋，真核生物中能消除正、负超螺旋）拓扑酶：切断DNA双链（同上）（三）单链DNA结合蛋白（SSB）维持模板处于单链状态 保护单链的完整,四、引物酶和引

8、发体引物酶：RNA聚合酶-Dna G引发体：Dna G 和 DnaB Dna A辨认复制启始点，然后解链酶Dna B在Dna C帮助下结合解链区，并在DNA拓扑异构酶协助下沿DNA链5 3方向解链，并由SSB蛋白保护单链。解链后，在复制起点DnaB活化Dna G，促使其合成RNA引物。,五、DNA连接酶（ligase）,催化两段DNA之间的连接,NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NMN:烟酰胺单核苷酸,+AMP,但实际上在切口处5端的往往是RNA引物切除后留下一个单磷酸基，不具备羟基亲和攻击的条件，由此：,DNA连接酶 催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键：（1）形成酶-AMP

9、复合物：NAD（细菌）连接酶-AMP+NMN+连接酶 ATP（动物）连接酶-AMP+PPi（2）形成A-P-P-DNA：连接酶-AMP+5P-DNAA-P-P-DNA+连接酶 形成了焦磷酸键（3）生成3,5-磷酸二酯键：DNA-OH3+A-P-P-DNADNA-O-P-DNA+AMP 相邻链3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击,第三节 DNA生物合成过程,一 复制的起始（一）复制起始点和复制叉 原核生物从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制,真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制起点，同时形成多个复制单位复制叉-复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜

10、下可看到的叉状结构，称为复制叉E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列,1、复制的起点：单个固定的起点：原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，具有单个固定的起点；多个起点：真核生物染色体是线性双链分子，含有许多起点多复制子）。,2、复制方向：直线双向式：单起点，双方向。有对称的和不对称多起点双向式：真核生物染色体DNA的复制型双、单向式：环状DNA的复制。有双向和单向（单向的形成一个复制叉，双向的形成两个复制叉），有对称和不对称（一个叉完成1/5，其余4/5由另一个叉完成）D-环式：单向复制。在固定点解开后一条链先复制，

11、待复制到一定距离时，露出另一链的复制起点，才开始另一链的复制,滚动环式：单向复制，低等生物如质粒 共价闭环双链分子的正链由核酸内切酶在一特定位点切开，游离出的5-磷酸基末端固定在细胞膜上，然后以环状负链为模板，从正链的3-OH末端延长形成正链。不需要另外合成引物。,（二）引发体的生成复制过程需要引物-短链RNA引物酶：合成RNA引物（十个bp左右），方向为5 到 3Dna A辨认复制启始点，然后引物酶（DnaG蛋白）进入，加上 DnaB蛋白和DnaC蛋白等，与DNA的起始复制区域形成引发体。DNA聚合酶 由其亚单位辨认引物，新链的第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键，开始复制拓扑异构

12、酶 松弛螺旋。,复制过程中各酶和蛋白质因子的作用,二 复制的延长原核生物为pol 真核生物为DNA 聚合酶和，其中与随从链的合成有关，与领头链的合成有关（一）复制延长的生化过程原核生物复制延长的速度很快真核生物复制有多个复制起点（二）复制的半不连续性和冈崎片段领头链是连续合成的，而随从链则是不连续合成冈崎片段：冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在于NA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段,三 复制的终止,（一）原核生物复制终止及不连续片段连接复制有终止点ter领头链是不间断延长的，随从链是 生成一个个的冈崎片段，最后连接成一条完整的

13、DNA链。pol 5 3外切酶活性水解引物pol聚合活性填补空隙DNA连接酶连接缺口。,pol,(二)真核生物的端粒和端粒酶端粒：是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 富含GC的重复序列人：(TTAGGG)n端粒酶：RNA-蛋白质复合物 既有模板，又有逆转录酶以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链,爬行模式端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关,第四节 DNA的损伤修复,突变-DNA分子上碱基的改变自发突变、人工诱变一 突变的意义突变是进化、分化的分子基础只有基因型改变的突变致死性的突变突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,诱变因素及突变类型,三、突变分子改变的类型错配（

14、点突变）一个碱基改变缺失、插入和框移突变片段插入或缺失重排较大片段重组或重排,四、损伤的修复,损伤-复制过程中发生的DNA突变光修复切除修复重组修复SOS修复,（一）光修复 紫外光照射可使相邻的两个T 形成二聚体（TT）光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。光修复酶的激活需300-600m波长的光。,（二）切除修复 参与的酶有 核酸内切酶，pol,DNA连接酶,核酸内切酶识别损伤部位切开核酸单链外切酶切除损伤部位聚合酶修复连接酶连接,（三）重组修复重组蛋白RecA，pol，连接酶参与。损伤会保留下去,聚合酶在损伤部位跳过去，在下一个冈崎片段的起始位置或前导链的相应位置上重新合成

15、引物和DNA链。这样，新链在损伤相对应处留下缺口。然后，完整的母链上相对应于损伤部位的正确核苷酸序列片段移到有缺口的新链上，而母链上的空缺则通过聚合来补上。损伤链的损伤并未除去，但在后代中已被稀释。,（四）SOS修复DNA损伤面太大，复制难以继续。复制的酶，修复的酶，重组蛋白RecA，调控蛋白LexA等组成一个庞大的调控网络。特异性很低着色性干皮病：患者缺乏特异的核酸内切酶，紫外光照射后易患皮肤癌,1、SOS反应诱导的修复系统：（1）避免差错修复：应急反应诱导产生修复所需的酶和蛋白，增强切除修复和重组修复能力；（2）倾向差错修复：应急反应诱导产生缺乏校对功能的聚合酶，可在损伤部位进行复制，但带

16、来高变异率。,2、诱导修复的机制：SOS反应是由RecA蛋白（在同源重组中也起重要作用）和LexA阻遏物相互作用引起的。未诱导细胞：RecA蛋白不具有蛋白水解酶活力 由lexA基因编码的LexA蛋白成为许 多基因（包括修复基因、recA基因 及lexA基因本身等）的阻遏物SOS反应：激活RecA蛋白的蛋白水解酶活力，对 LexA蛋白产生水解作用，由此解除了 许多基因的抑制，产生包括修复中关 键酶和蛋白质的产物。SOS反应（激活）RecA蛋白（水解）LexA蛋白（消除阻遏物LexA蛋白）产生关键酶或蛋白质。,第五节 逆转录现象和逆转录酶,RNA病毒逆转录酶(reverse transcripta

17、se,RT)逆转录活性(依赖于RNA的DNA聚合酶活性)RNaseH 活性DNA聚合酶活性(依赖于DNA的DNA聚合酶活性),本章要点,1、掌握生物学中心法则。2、掌握DNA聚合酶催化的反应，复制保真性依赖的机理。3、掌握DNA点突变、缺失、插入、倒位的概念、损伤的修复方式。4、掌握半保留复制，不连续复制的概念。5、熟悉解链酶，拓扑异构酶，引物酶及DNA 连接酶催化的反应。,复习思考题,1、DNA复制时不需要下列哪一种酶？A DNA指导的DNA聚合酶 B RNA指导的DNA聚合酶C DNA指导的RNA聚合酶D 连接酶E 拓扑异构酶 2 下列过程中不需要DNA连接酶参与的是A DNA 复制 B DNA重组C DNA 修复 D DNA修饰,3 DNA 复制时，如模板链为 5-TAGA-3将会合成哪种互补结构？A 5-TCTA-3 B 5-ATCT-3C 5-UCUA-3 D 5-AUCU-34 名词解释半保留复制 领头链 随从链 岗崎片段点突变5 在DNA 半保留复制中，两条新合成的链为什么都可以53延长？,