生化分析-化学检测技术课件.ppt

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1、化学检测技术,化学与生命科学学院,生化检测分析,化学检测是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法。,第一节 糖类的化学检测,碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。自然界中糖类包括多糖、双糖、单糖单糖和某些双糖具有游离羰基还原糖多糖和蔗糖等无还原性非还原糖,一、定义和分类,二、糖类的化学检测原理,糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂,斐林试剂基本组成：A：CuSO4 溶液 B：NaOH和酒石酸钾钠 溶液 使用时A、B等体积混合(生成

2、酒石酸钾钠铜）,酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。,三、测定糖常用方法,1、兰爱农（Lane-Eynon）法本方法又称次甲基蓝法、置换法、直接滴定法用次甲基蓝作为指示剂，直接用还原糖滴定到斐林试剂中进行测定的方法。,红色,由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失！,蓝色,无色,多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定。如淀粉，可用酸解或酶解。,2、斐林试剂快速法（GB法）：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）。红色的氧化亚铜沉淀与亚铁氰化钾络合生成可溶性的复盐，反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。,本方法是

3、在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显，反应终点比兰爱农法更为明显。本法是国家标准分析方法。,3、次碘酸钠法4、铜试剂法,第二节 蛋白质和氨基酸的化学检测,蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。,含氮量 每克N相当蛋白质肉、蛋、豆 16 6.25面

4、粉 17.6 5.70奶品 15.7 6.38花生 18.2 5.50鲑精蛋白 31.5 3.17,蛋白质含有多个肽键，因此可用双缩脲试剂及由其发展而来的福林酚试剂进行蛋白质的测定。蛋白质的基本组成单位是氨基酸。通过末端氨基酸分析，则可弄清蛋白质中氨基酸的种类和排列顺序。,一、定氮法测定蛋白质的含量,凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（经典的，仲裁的）1.原 理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,（3）(N

5、H4)2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O,（4）2NH3+H3BO3(NH4)2B4O7+5 H2O（5）(NH4)2B4O7+5 H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3,消化：取一定量样品放进凯氏定氮瓶，加入一定量K2SO4、CuSO4、浓H2SO4，通风厨内进行。消化结束，消化液全部移入100mL容量瓶定容。,2.操作要点,A.硫酸钾的作用,加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下：K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O+SO3一般纯硫酸的沸点在340左右，而添加硫酸钾后，可

6、使温度提高到400以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4 NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4 2NH3+2SO3+2H2O,B.硫酸铜的作用,催化剂 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。可以指示消化终点的到达。,（2）蒸馏、吸收,（2）蒸馏、吸收,接收瓶内加入2%硼酸溶液10ml 及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下；准确吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入

7、反应室，并以10ml水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。蒸馏5min，移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。,（3）滴定,全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变成淡紫红色，即为滴定终点。,（4）计算,蛋白质含量样品的总氮量6.25,3、自动凯氏定氮法,（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（

8、3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,二、双缩脲试剂法测定蛋白质,蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。蛋白质（多肽）CuSO4、NaOH 紫红色化合物（铜钠双缩脲络合物）颜色深浅与蛋白质含量成正比，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。,三、福林酚试剂法测定蛋白质含量,双缩脲法的发展，灵敏100倍，需时较长，对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。碱性铜试剂双缩脲反应稀释的苯酚试剂与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色两种呈色反应可叠加,四、氨基酸的测定,（一）茚三酮比色法1.原理 氨基酸在碱性条件下

9、与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反应物的吸光度（570nm）可计算出样品中氨基酸含量。,2.试剂 2%茚三酮 pH8.04磷酸缓冲溶液 氨基酸标准溶液3.仪器 分光光度计,蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。,（二）氨基酸自动分析仪法,操作：（1）双缩脲试剂的配制 CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI(2)标准曲线的制作1标准酪蛋白(mL)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水(mL)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0双缩脲试剂(mL)4 4

10、4 4 4 4室温反应30min测A540(3)样品测定 1mL4mL双缩脲试剂，30min，测A540,操作：（1）福林酚试剂的配制甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸钾钠)乙液：稀释的苯酚试剂（2）标准蛋白溶液配制结晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）（3）标准曲线制作（4）样品测定1mL样品（含P15500 g）5mL甲液，室温10min，乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500750,蛋白质的免疫化学检测,概念：免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、沉淀反应检测方法：（1）凝集反应效价测定，细菌、病毒分类（2）沉淀反应沉淀反

11、应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等,氨基酸含量测定方法,1 茚三酮显色法微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物取1mL样品溶液（含氨基酸0.150ug)加1mL缓冲液（pH5.06.7），再加1mL茚三酮显色液，100 水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440,2 甲醛滴定法测定氨基酸,氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。加进甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。注意：需用过量中性甲醛。,三 核酸的化学检测,根据核酸所含

12、的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。1 定磷法测定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的测定 定磷试剂，45 水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线（3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5,RNA含磷9.2，RNA量（总磷量无机磷量）10.9DNA量（总磷量无机磷量）10.5,2 二苯胺法测定DNA含量,DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40400 g范围内，OD595与DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。（1）二苯胺试剂的配制（2）标准曲线制作（3）样品DNA含量测定,3

13、地衣酚法测定RNA含量,核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。操作：地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定,思考题,1 如何区别还原糖与非还原糖？举出常见的还原糖与非还原糖。2 有哪些定糖方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。3 如何测定薯类淀粉含量？4 蛋白质含量测定有哪些方法？熟悉各种方法的原理，所用试剂和操作要点。5 如何用滴定法测定氨基酸含量？7如何用定磷法测定DNA或RNA含量？8 二苯胺测定DNA和地衣酚测定RNA原理？9 三瓶未知液

14、分别为蛋白质、糖和RNA，如何鉴定？,2 碘量法,I2 NaIO(氧化剂），其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘,碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液，摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：以5mL

15、样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量（V0 V1）C M n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如果糖）,3 铜试剂法,将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。（1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘（2）标准曲线的制作,（a)标准葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根据所用铜离子试剂定）（b)三角瓶编号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（mL)0 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL)5 4 3 2 1 0 铜试剂（mL)5 5 5 5 5 5 沸水浴

16、10min，冷却至室温（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V(d)绘标准曲线葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标,操作要点,（1）斐林试剂的标定（a）标定预备试验 A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V1mL。（b）标定A、B各5mL10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2滴1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内

17、完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V0,(2)定糖（a）定糖预备试验A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1或0.2）V2mL。（b）定糖A、B各5mL10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V,(3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）（V0-V)c(1/10)n注意：（a）AB分开储存，防止Cu2+变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热。,4.测定方法（1）样品处理 称样加水、活性炭加热提取过滤滤液定容（2）标准曲线制备与样品测定,5.结果计算,