生物技术毕业论文1.doc

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1、1引言人类生命物体的基本特征之一就是不断地进行新陈代谢，新陈代谢是由许多有机化学反应组成的，如动植物的消化反应和各种物质的合成与分解等。这些反应在体内进行地很快，原因是有生命的动植物体内存在着的一种生物催化剂一酶的作用。酶制剂是在1833年由法国化学家佩思和珀索发现的，他们从麦芽提取液的酒精沉淀物中得到一种对热不稳定，而且能加速淀粉转变成糖的物质，称之为淀粉酶制剂。1926年隆姆首次从刀豆中提纯得到脲酶结晶1。生物化工行业经过70多年的发展，对酶的分子结构，酶作用的机理及酶系统的自我调节已形成了一个完整的工业体系。整个行业也出现了一些新的发展态势，在阐明生命活动的规律，探索工业、农业、畜牧业、

2、医药及对疾病的诊断、治疗均有重要的意义。2 酶在工程技术反应中的特点与功能2.1酶及酶工程简介酶（enzyme）（图2-1）是指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。 图2-1 酶哺乳动物的细胞就含有几千种酶。它们或是溶解于细胞质中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上。这些酶统称胞内酶；另外，还有一些在细胞内合成后

3、再分泌至细胞外的酶胞外酶2。酶催化化学反应的能力叫酶活力（或称酶活性）。酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收和利用。在胃里有胃蛋白酶，在肠里有胰脏分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等。又如食物的氧化是动物能量的来源，其氧化过程也是在一系列酶的催化下完成的。酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的

4、一门科学技术。它包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中1。2.2 酶的特点2.2.1 酶与无机催化剂比较（1）相同点：改变化学反应速率，本身几乎不被消耗；只催化已存在的化学反应；加快化学反应速率，缩短达到平衡时间，但不改变平衡点；降低活化能，使化学反应速率加快。都会出现中毒现象。 （2）不同点：即酶的特性。2.2.2 酶的特性（1）高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快； （2）专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽； （3）多样性：酶的种类很多，大约有4000多种

5、； （4）温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。 （5）活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。 （6）有些酶的催化性与辅因子有关。 （7）易变性：由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。 一般来说，动物体内的酶最适温度在3540之间，植物体内的酶最适温度在4050之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70。动物体内的酶最适PH大多在6.58.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.5，植物体内的酶最适PH大多在4.56.5之间。 酶的这些性质使细胞内错综复杂的物质代谢过程能有条不紊地进行，

6、使物质代谢与正常的生理机能互相适应若因遗传缺陷造成某个酶缺损，或其它原因造成酶的活性减弱，均可导致该酶催化的反应异常，使物质代谢紊乱，甚至发生疾病因此酶与医学的关系十分密切。2.2.3 酶的功能全酶(结合蛋白酶)：酶蛋白+辅助因子。辅助因子是结合蛋白必需成分。它包括辅酶(或辅基)和金属离子两类。辅酶或辅基是一些小分子的有机化合物，其中大多数都是维生素B族的衍生物。酶活力与酶分子的结构有着密切的关系。酶蛋白的氨基酸组成和连接方式与一般蛋白质一样，都具有特定的氨基酸排列顺序和空间构造。实验证明：在酶蛋白分子中，只有某些氨基酸残基的化学基因与催化活性直接有关，由这些氨基酸残基构成特殊结构的区域称为酶

7、的活性中心。活性中心所包含的化学基因为发挥酶催化作用所必需的关键部位。有些酶(绝大多数为蛋白水解酶)在细胞内合成或初分泌时并不表现有酶活力，这种无活性状态的酶前身物称为酶原。它必须经温度因素作用后转变成有活力酶，这种过程称为酶原的激活。以酶原的形式存在具有重要生理意义。如细胞产生的蛋白酶原可以避免对细胞自身蛋白质的消化作用。当蛋白酶原由细胞分泌排入肠腔时，酶原被激活而发挥催化作用。现代研究中多广泛运用同工酶，它是化学反应相同，而酶蛋白的结构和理化性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一机体的不同组织细胞中。自1959年首先发现乳酸脱氢酶(LDH)同工酶以来，已发现同工酶约有500多种

8、，其中研究应用最多的是LDH同工酶。广泛用于生物化工中，对研究细胞分化、遗传、生态、工业、农业的经济性状，抗病力和疾病诊断等探讨具有一定的意义2。3 酶在工程技术中的基本原理3.1 催化作用原理酶催化作用实质：降低化学反应活化能。酶的作用原理在于研究酶与底物相互作用和变化的过程。下面来说明酶为什么会有这样高的催化效率：在化学反应体系中，反应物分子所含的能量并不相同，但平均能量水平较低。在反应的一瞬间，只有那些含能量分子较高，已达到或超过一定水平的分子才能参与化学反应，即反应物分子必须超过一定的能量，才能成为活性状态，这种分子叫活化分子。反应物分子由一般状态转变为活化状态所需要的能量，称为活化能

9、。反应体系的活化分子愈多，反应速度就愈快。酶能显著地降低反应活化能，加速化学反应。所以催化效率比一般催化剂高。3.2 酶的活力1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1min 内能转化1mol底物的酶量，或是转化底物中1mol的有关基团的酶量。 比活力（specific activity）:每分钟每毫克酶蛋白在25下转化的底物的微摩尔数。比活力是酶纯度的测量。 活化能（activation energy）:将1mol反应底物中所有分子由基态转化为过度态所需要的能量。 活性部位（active site）:酶中含有底物结合部位和参与催化底物转化为产物的

10、氨基酸残基部分。活性部位通常位于蛋白质的结构域或亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上靠得很紧的一些氨基酸残基组成。3.3 酶活力测定初速度(initial velocity)：酶促反应最初阶段底物转化为产物的速度，这一阶段产物的浓度非常低，其逆反应可以忽略不计。 米氏方程（Michaelis-Mentent equation）:表示一个酶促反应的起始速度（）与底物浓度(s)关系的速度方程：=maxs/(Km+s) 催化常数等于最大反应速度除以总的酶浓度（max/Etotal）。或是每摩酶活性部位每秒钟转化为产物的底物的量（摩尔）。 双倒数作图（图3-1）:也称为Lin

11、eweaver_Burk作图。一个酶促反应的速度的倒数（1/V）对底物度的倒数（1/CS）的作图。x和y轴上的截距分别代表米氏常数和最大反应速度的倒数。图3-1：米氏常数的图解计算双倒数作图法3.4 影响酶反应速度的因素3.4.1 酶浓度对酶促反应速度的影响 从米门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系图解可以看出：酶促反应速度与酶分子的浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。但事实上，当酶浓度很高时，并不保持这种关系，曲线逐渐趋向平缓。根据分析，这可能是高浓度的底物夹带夹带有许多的抑制剂所致。 3.4.2 底物浓度对酶促反应速度的影响 在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物

12、的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加。 还可以得出，在底物浓度相同条件下，酶促反应速度与酶的初始浓度成正比。酶的初始浓度大，其酶促反应速度就大。 在实际测定中，即使酶浓度足够高，随底物浓度的升高，酶促反应速度并没有因此增加，甚至受到抑制。其原因是：高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，从而降低了酶促反应速度。过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度。 3.4.3 温度对酶促反应速度的影响 各种酶在最适温

13、度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10，酶促反应速度可以相应提高12倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为3740；微生物体内各种酶的最适温度为2560，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为6264；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为8594。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。 最适温度在60以下的酶，当温度达到6080时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100时，酶的催化作用完全丧失。

14、3.4.4 pH对酶促反应速度的影响 酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在两个方面：改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。人体中的大部分酶所处环境的pH值越接近7，催化效果越好。但人体中的胃蛋白酶却适宜在pH值为12的环境中，胰蛋白酶的最适pH在8左右4。 3.4.5 激活剂对酶促反应速度的影响 能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；有机化合物，如维生素C、半

15、胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。许多酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。而有些酶被合成后呈现无活性状态，这种酶称为酶原。它必须经过适当的激活剂激活后才具活性。 3.4.6 抑制剂对酶促反应速度的影响 能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对-氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。 对酶促反应的抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。与底物结构类似的物质争先与酶的活性中心结合，从而降低酶促反应速度，这种作用称为竞争性抑制。

16、竞争性抑制是可逆性抑制，通过增加底物浓度最终可解除抑制，恢复酶的活性。与底物结构类似的物质称为竞争性抑制剂。抑制剂与酶活性中心以外的位点结合后，底物仍可与酶活性中心结合，但酶不显示活性，这种作用称为非竞争性抑制。非竞争性抑制是不可逆的，增加底物浓度并不能解除对酶活性的抑制。与酶活性中心以外的位点结合的抑制剂，称为非竞争性抑制剂。有的物质既可作为一种酶的抑制剂，又可作为另一种酶的激活剂。4 酶在工程技术中的开发研究酶工程技术包括酶源开发、酶制剂生产、酶分离提纯和固定化技术，酶反应器与酶的作用。目前世界酶制剂从酶源的应用都已进入了良性发展阶段，各级生产企业和科研院所与用户关系密切，合作广泛。据报道

17、，2010年全球工业酶制剂的销售额为30亿美元，预计到2020年将增长到60亿美元，每年为65的速率增长。其中食用酶占40，洗涤用酶占33，其他(主要是纺织、造纸和饲料等用酶)占275。（图4-1）.图4-1：酶制剂在各行业所占百分比利用基因工程技术，不但成倍地提高了酶的活力，而且还可将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因菌产生酶。利用基因工程，使多种淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、氨基酸合成途径的关键酶得到改造、克隆，使酶的催化活性、稳定性得到提高。氨基酸合成的代谢得到拓宽，产量提高。随着基因重组技术的发展，被称为第二代基因工程的蛋白质工程发展迅速，显示出巨大潜力和光辉前景。利用蛋白质工程，将可以生

18、产具有特定氨基酸顺序、高级结构，理化性质和生理功能的新型蛋白质，可以定向改造酶的性能，从而研究生产出新型的生化产品。在生物化工中酶得到了极大的应用，比如，在超临界液体状态下进行酶反应，从而大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率。超临界CO2无毒，不可燃烧，化学惰性，易与反应底物分离。利用超临界CO2取代有机溶剂进行酶反应，具有极大的发展研究开发价值。5 酶在各领域工程技术上的应用5.1 在畜牧业上的应用早在19世纪后期，人们就逐渐发现了酶。酶作为饲料添加研究已有几十年的历史。最早华盛顿大学聊等(1958年)开始在大麦为基础原料的饲料中加入酶来水解非淀粉多糖，然后用来饲喂肉鸡，并取得良好效

19、果。从此，一大批欧洲国家相继进行酶添加剂的推广应用，直到19世纪80年代初才受到世界各国的重视。随着生化技术手段的更新，酶制剂工业在我国得到了迅速发展。目前，我国各种蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、微生物复合酶等饲料正在不断涌现。新型的生物化工酶系添加饲料的优点，具有显著加快动物生长，提高饲料使用效率，增强抗病力，提高幼年动物成活率，减少患病率，降低兽医药费开支等一系列有益作用。当前，在日常生活中污染排放着大量富含蛋白质的废弃物，这类废弃物是些不可食用的生活垃圾，而利用酶技术将这些废弃物在制作堆肥和发酵处理中起重大的作用，这些酶也可以将废弃物质变成优质的蛋白饲料。5.2在遗传育种中的应用有些酶或同工

20、酶，可作为动物遗传标记，用于估计种群问的亲缘关系，作为品种的遗传标记，品种形成的分析，亲子关系的鉴别，以及与经济性状的关系等。特别是同工酶技术发展以来，应用同工酶的改变，作为动物遗传标记。有简便、灵敏等优点，已受到研究畜牧业工作人员的重视。如碱性磷酸酶同工酶与母鸡的产蛋性能有密切关系。5.3在医学上的应用酶与疾病有如下几种关系：遗传性疾病，由于先天性原因发生酶缺陷，从而阻碍代谢的进行，如白化病患者，体内酪氨酸酶缺乏。以致没有黑色素生成，致使患者的皮肤、毛发均为白色；不可逆抑制引起的疾病，特异性的不可逆抑制剂不是一种，常用的有机磷农药能与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶的活力减弱或丧失，从

21、而影响神经传递质的正常工作而致病；酶与疾病的诊断，酶在机体组织内有一定的定位和分布，正常人体液中的酶含量相对稳定。正常酶活力有一定的范围，在某种疾病发生或发展的过程中，血液与其他体液中酶活力有显著改变。所以测定体液特别是血清中某些酶活力的升高和降低，对疾病的诊断和预防有重要意义。在研究血清中出现酶活力改变大致有以下几种情况：当细胞损伤或通透性增加时，定位于细胞内的某些酶大量释放入血液，此时血清中某些酶活力升高，如急性肝炎患有血清CPI活力增加；细胞内酶合成速度增加，以致释放入血液的酶也随之增多，如恶性肿瘤转移的患者，血清中LDH活力增高；酶的排泄障碍，例如碱性磷酸酶可通过胆道排泄，胆道梗阻时，

22、该酶的排泄障碍而又回流入血液，引起血清酶活力显著增高。5.4酶在疾病防治中的应用正常人体内酶活性较稳定，当人体某些器官和组织受损或发生疾病后，某些酶被释放入血、尿或体液内。如急性胰腺炎时，血清和尿中淀粉酶活性显著升高；肝炎和其它原因肝脏受损，肝细胞坏死或通透性增强，大量转氨酶释放入血，使血清转氨酶升高；心肌梗塞时，血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶明显升高；当有机磷农药中毒时，胆碱酯酶活性受抑制，血清胆碱酯酶活性下降；某些肝胆疾病，特别是胆道梗阻时，血清r谷氨酰移换酶增高等等。因此，借助血、尿或体液内酶的活性测定，可以了解或判定某些疾病的发生和发展6。 近年来，酶疗法已逐渐被人们所认识，广泛受到重视

23、，各种酶制剂在临床上的应用越来越普遍。如胰蛋白酶、糜蛋白酶等，能催化蛋白质分解，此原理已用于外科扩创，化脓伤口净化及胸、腹腔浆膜粘连的治疗等。在血栓性静脉炎、心肌梗塞、肺梗塞以及弥漫性血管内凝血等病的治疗中，可应用纤溶酶、链激酶、尿激酶等，以溶解血块，防止血栓的形成等。 一些辅酶，如辅酶A、辅酶Q等，可用于脑、心、肝、肾等重要脏器的辅助治疗。另外，还利用酶的竞争性抑制的原理，合成一些化学药物，进行抑菌、杀菌和抗肿瘤等的治疗。如磺胺类药和许多抗菌素能抑制某些细菌生长所必需的酶类，故有抑菌和杀菌作用；许多抗肿瘤药物能抑制细胞内与核酸或蛋白质合成有关的酶类，从而抑制瘤细胞的分化和增殖，以对抗肿瘤的生

24、长；硫氧嘧啶可抑制碘化酶，从而影响甲状腺素的合成，故可用于治疗甲状腺机能亢进等3。每不仅用于诊断，亦可用于治疗。经研究与应用发现酶制剂具有以下几种情况：应用于治疗消化不良辅助药物，这主要是一些水解酶类，如胃蛋白酶、淀粉酶、多酶片等；应用于外科扩刨，化脓伤口净化及胸腔，腹腔浆膜黏连的酶制剂有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等；应用于治疗弥漫性内凝血，血栓等的酶制剂有血液纤维蛋白溶酶，链激酶和尿激酶等；应用于治疗癌症的对抗药物。如天冬酰胺酶等；应于治疗高脂蛋白血症的酶制剂有弹性蛋白酶等6。结束语综上所述，生物化工中酶的产品正向专业化高科技含量，高附加值方向方展。利用蛋白质工程技术将可以生产具有特定氨基酸顺序

25、，高级结构，理化性质和生理功能的新型蛋白质，可以定向改造酶的性能，从而生产出新型的现代化工产品。另外，还应积极采用微生物代替化学法，有利于开发现代化工新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物化工产业的发展7。致 谢本论文得以顺利完成，首先应该感谢李威老师，正是由于您的悉心指导、热情鼓励及在繁忙的工作中抽出时间来为我指导，我才能顺利完成我的项目。感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学，和曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们，在大学生活即将结束的最后的日子里，我们再一次演绎了团结合作的童话，把一个庞大的，从来没有上手的课题，圆满地完成了。正是因为有了你们的帮助，才让我不仅学到了本次课题所涉及

26、的新知识，更让我感觉到了知识以外的东西，那就是团结的力量。作为江汉大学文理学院大学的一名毕业生，我更要感谢生物与环境工程学院给了我能够学习不同学科知识的机会。在三年的生物技术及应用专业学习过程中，任课老师们的学识渊博、治学严谨、人品高尚无时不在影响着我。学习的时间是短暂的，但老师们的影响却是我终生收益不尽的。在此对我的老师们深表感谢！另外，感谢校方给予我这样一次机会，能够独立地完成一个课题，并在这个过程当中，给予我们各种方便，使我们在即将离校的最后一段时间里，能够更多学习一些实践应用知识，增强了我们实践操作和动手应用能力，提高了独立思考的能力。再一次对我的母校表示感谢。我相信，在未来的日子里我会更加努力学习，充分利用所学知识，回报社会、学校和师长！