生物工程毕业论文 .doc

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1、学士学位论文烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变题 目 类 别 毕业论文 系 别 生物工程系 专 业 班 级 08014101 学 生 姓 名 张尚昆 指 导 老 师 周念波 辅 导 老 师 黄 英 起 止 时 间 2011年10月至2012年5月 论文提交时间 2012年5月 二零一二年五月论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 年 月 日

2、目录摘 要关键词AbstractKey words前言11.1 材料41.1.1 样品41.1.2 实验试剂41.1.3 酶41.1.4 仪器与设备41.1.5 培养基41.2 实验方法51.2.1 筛选育种过程51.2.2 出发菌株烟色曲霉分解壳聚糖能力检测51.2.3 酶液的配制51.2.4 孢子悬液的制备51.2.5 制备原生质体51.2.6 原生质体的紫外诱变及再生51.2.7 高产菌株的检出52 结果和分析62.1 烟色曲霉原生质体制备培养条件优化62.1.1菌龄对原生质体产率的影响62.1.2 酶液pH对原生质体产率的影响62.1.3 酶作用温度对原生质体产率的影响72.1.4 酶

3、作用时间对原生质体产率的影响82.2 原生质体紫外照射剂量的确定92.3 紫外诱变结果93 结论10参考文献11致 谢12烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变摘 要本实验以烟色曲霉（Monacus fulginosus）为出发菌株,用混合酶制取原生质体并对原生质体形成条件进行探讨,并进行紫外诱变选育。采用18 h菌龄的菌丝体,使用pH为5.0的蜗牛酶（5mg/ml）+纤维素酶（5 mg/ml）复合酶液，30 下酶解2.5 h,在该条件下原生质体浓度可达6.5106个/mL,再生率为6.3%。在最佳紫外线照射时间90 s下,突变株经筛选,得到一株降解壳聚糖的酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株。其酶活比

4、出发菌株提高了1.23倍。关键词烟色曲霉；壳聚糖酶；原生质体；紫外诱变Protoplast Preparation and Breeding of Higher Esterifying Enzyme Activit Mutants by Protoplast Mutagenesis of Ultraviolet Irradiation of Monacus fulginosus Abstract Using Monacus fulginosus as the original strain,Studied on the preparation and regeneration conditio

5、ns of protoplasts by mutagenesis of ultraviolet irradiation。The results showed that treated 18h culture of Monascus ruber with 5mg/ml snail enzyme and 5mg/ml Cellulose enzyme whose pH is 5.0, the enzymolysis time was 2.5 hours, the enzymolysis temperature was 30 , the protoplasts could reach 6.5106

6、unit/mL, and the regeneration rate reached up to 6.3%。Under UV irradiation time in the best case for the 90s, After initially sieving and duplicate sieves,the mutagenesis strain which own increasing enzyme activity and transmissibility was obtained。Its esterifying enzyme content is 1.23 times higher

7、 than the original strain。Key wordsMonacus fulginosus; Chitosan enzymes; protoplast; ultraviolet mutagenesis前言 原生质体是指细胞壁被酶水解剥离后，剩下由原生质膜包围的原生质部分原生质体通常是由对数生长期的细胞制备而来的，代谢旺盛复制频繁生活力强对诱变剂的敏感性也强，诱变后易于形成单菌落而便于筛选；同时，原生质体还具有细胞壁再生能力，保持了细胞的全能性，可以按照常规的细胞诱变方式对其进行诱变，从而提高突变株的变异幅度，诱变效果更为理想1。1研究背景与意义自Buchman和Bonner在1

8、959年首次报道利用酶解破壁方法从粗糙脉孢霉菌丝体释放原生质体以后，在其他各种真菌的原生质体制备和再生的研究陆续开展，极大丰富了人们对真菌细胞外表和其生理功能的知识，尤其对于20世纪70年代中期兴起的原生质体融合遗传育种手段在丝状真菌的应用起到了启动作用2。对于烟色曲霉的原生质体制备、再生以及原生质体诱变育种技术的研究也日益增多。但是自然筛选的烟色曲霉产酶水平一般较低，无商业开发价值，而诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法。由于各种诱变剂对微生物的作用位点和方式不尽相同， 因此，反复使用同一诱变因子会出现钝化现象可能引起微生物的回复突变，这就要求在烟色曲霉进行诱变育种时要尽量选用新的诱变因

9、子，才会有较大可能性取得成功。原生质体由于去除外壁障碍，对各种诱变剂敏感性较强，往往正突变率高，因而利用原生质体直接诱变经过多种诱变剂处理过的钝化株，是较有意义的诱变方法。 基于上述原因，人们采取各种手段以获得稳定性产酶菌株。潘力等人2006年对酱油曲霉孢子原生质体的制备条件进行优化，得到酱油曲霉BI孢子原生质体的制备条件为：选取培养5 d、绿色孢子开始旺盛生长的新鲜斜面培养物制备孢子悬浮液，采用25 mmol/ L-巯基乙醇 + 5 mmol/L Na2 EDTA 体系预处理20 min，酶解条件是1%溶菌酶 + 1%蜗牛酶 + 1%纤维素酶，山梨醇渗透压稳定剂(0.6 mol/ L，pH

10、6.88)，酶解温度33 ，酶解5 h，再生培养基为0.6 mol/L NaCl 高渗透压豆汁培养基，涂布法再生。选用致死率为99.95%以上的诱变剂量对制备的原生质体进行紫外诱变处理，最终从230余株突变株中筛选得到7株酶活有较大提高的菌株系列U，遗传稳定性试验证明它们均具有高水平且稳定的中性蛋白酶酶活3。王燕2007年对双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究得出原生质体制备最佳条件为：最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合，混合浓度比为5:3:1；菌丝培养15 h，酶解时加入DTT 3 mmol/L；酶解2.5 h，0.8 mol/L NaCl作为渗稳剂，制备所得原生质体融

11、合后融合率达到3.31%4。 李萍等于2000年对黑曲霉原生质体进行紫外、LiCl复合诱变，获得了1株产-葡萄糖甘酶活较高的菌株，其酶活有出发菌株的10 U/mL提高到14.7 U/mL2。郭鲁宏等2000年以黑曲霉（Aspergillus niger）No.13为出发菌株，经紫外线处理，获得1株制备原生质体的起始菌，该菌株单宁酶活性比No.13提高55%；并对制备原生质体的条件进行了研究，在优化方案基础上，紫外诱变原生质体，诱变菌株经筛选，得到1株产单宁酶活是出发菌株的2倍的菌株2。彭益强等2002年将2株黑曲霉菌株（I、II）在诱导产植酸酶的条件下分别制备成原生质体，并考察其原生质形成及再

12、生，经紫外诱变后，发现涂平板的黑曲霉（II）原生质体在再生过程中菌落形态发生明显变化。考查突变菌种的植酸酶酶活，筛选到其中1个变异株比原始黑曲霉（II）亲本株的植酸酶酶活提高了2.2倍2。2曲霉原生质体的性质2.1 烟色曲霉原生质体Weibull13等于1953年首先提出原生质体概念。用水解酶将细胞壁水解剥离，剩下由原生质体膜包围着的原生质体部分称为原生质体（protoplast）。其形状随不同菌类而异。原生体基本保持原细胞结构、活性和功能，只是因为去掉了细胞壁，对渗透压和外界环境特别敏感。为制备原生质体，必须有效地除去细胞外的细胞壁。去壁的方法有机械法、非酶分离法和酶法。实际工作中绝大多数采

13、用酶法，时间短，效果好2。2.2 原生质体的生物学特性原生质体与完整细胞相比，细胞结构和功能是相类似的；来自不同菌丝部位的原生质体，生理生化特性不同，对诱变剂的敏感也不同，从菌丝顶端分离出的原生质体代谢活动要强；去壁后的原生质体对外界条件敏感，并且外界大分子如外源DNA等容易进入细胞内；原生质体在一定条件下容易再生成细胞壁而复原为完整细胞形态；原生质体由于剥去了细胞壁，等于失去了屏障，外界的因素本身对它就有影响，再加上用诱变剂诱变，对原生质体的变异作用更强。可以提高诱变强度，增加诱变的力度，提高高频诱变的机率，使菌株变异的幅度大大加强，有可能从中筛选出变异特性更强、性状改变更大的菌株2。2.3

14、 曲霉原生质体的释放过程 曲霉原生质体和其他许多常见丝状真菌一样，可以从菌丝顶端和其他部位释放，同时出现菌丝膨大变形，这是由于细胞壁已被水解掉，细胞膜凸出将要成为原生质体。原生质体释放时，通常是在菌丝体的释放部位先膨大形成一个小球体，然后该球体逐渐增大，最后脱离菌丝，有的还可以在原有的释放部位紧接着又形成一个或几个原生质体，这可能是由于菌丝体有关泡囊形成与细胞膜融合的机制所导致的。有报道认为，在菌丝上缓慢膨大脱落的原生质体较为稳定，很快形成的原生质体则很脆弱。释放的原生质体多呈球形，大小不一，直径为1 m20 m，但以直径为5 m10 m 的中等大小的原生质体最多，其原生质体中一般含一个巨大的

15、液泡，其余的内含物呈月牙形，透明性较液泡差。郝勃等在相差显微镜下详细地观察了2 株黑曲霉在最适条件下形成原生质体的过程。结果表明，曲霉的原生质体均能从菌丝体的顶端及其他部位释放出来，释放的原生质体呈球形，大小不一，大多数原生质体内均能清晰地看见含有一个巨大的液泡2。2.4 曲霉原生质体的制备制备原生质体是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。对于曲霉，由于其细胞壁组成较为复杂，人们多倾向于使用复合酶进行处理

16、，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁酶等。不同黑曲霉菌种在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶浓度、酶解液配比、菌丝的菌龄、酶处理的温度和时间、培养方法及其他因素也存在着差异2。2.5 烟色曲霉酶解壳聚糖的催化特性大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着一乙酰化度、一取代基团及其不同取代位置以及均相和非均相反应体系而变化的。研究显示，壳聚糖酶在降解壳聚糖时，需要有一定的乙酰基协助催化降解，在乙酰度不高的情况下，随着壳聚糖的乙酰度降低，酶的活性增高，低聚壳聚糖的收率增大，而且降解时间是控制产物聚合度的关键因素。一些研究表明，不同

17、来源的壳聚糖酶由于其氨基酸排列顺序及分子量不同，其催化作用模式也不同。Yoon等5对Bacillus sp.CK 4产的壳聚糖酶进行了定点突变研究，发现当Asp-66改为Asp或Glu时酶活力显著下降，推测Asp-66是该酶催化活性中心所必需的氨基酸残基。来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙酰化程度的壳聚糖和壳聚糖衍生物(乙二醇壳聚糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖)有不同的特异性，但是一般不能降解胶体几丁质和纤维素，这也是判断壳聚糖酶和几丁质酶的一个重要标准。Hutadilok等6研究发现Bacillus pumilus产的壳聚糖酶在均相体系反应中，随着N-乙酰化程度的提高，米氏常数( Km)升

18、高，最大反应速率( Vmax)降低。在非均相反应中，具有一定取代度的N一乙酰化壳聚糖比壳聚糖更容易被水解，但当脱乙酰化度小于36 时，壳聚糖不溶于水，因而难以被水解。3原生质体紫外诱变微生物在一定酶的作用下，脱去细胞壁，只有在高渗压培养基中存活， 并在合适的培养基中恢复细胞壁而再生7。由于原生质体失去细胞壁的屏障，故对环境、诱变剂等更为敏感，因此用原生质体作为诱变材料，诱变效果较传统方法理想。酶法制备原生质体的方法：首先选择原始亲株，用培养皿玻璃纸法或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度、pH值等）酶解细胞壁。酶解后混合液用玻璃漏斗过滤，滤液进一步离心

19、洗涤弃上清液，沉淀悬浮同一种高渗液中，即可得纯化原生质体8。原生质体失去了细胞壁的屏障，外界的因素本身对它就有影响，再加上用诱变剂诱变，对原生质体的变异作用更强。可以提高诱变强度，增加诱变的力度，提高高频诱变的机率， 使菌株变异的幅度大大加强，有可能从中筛选出变异特性更强，性状改变更大的菌株。原生质体诱变经常会引起较多菌株形态变异，如孢子颜色、菌落形态不同等，因此，在进行原生质体诱变再生育种时，结合分离形态突变株，可以在短期内获得超敏高产菌株。4本实验研究意义烟色曲霉是发酵工业和食品加工业的重要菌种9。现代工业常利用烟色曲霉生产各种酶制剂。壳聚糖酶属于其中的一种，壳聚糖酶属于O-糖苷水解酶，能

20、专一性降解壳聚糖生成单糖和壳寡糖，壳寡糖具有较高的溶解性和生理活性，能提高机体的免疫和抗癌能力，改善肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长，还可作为植物功能调节剂，刺激植物生长。但烟色曲霉的产壳聚糖酶的水平比较有限，而且目前有关于提高烟色曲霉筛选产壳聚糖酶的报道较少，有的几篇也只局限于从天然源获得的产酶菌株，因此有必要对烟色曲霉产霉菌进行诱变选育，以提高产壳聚糖酶的水平和生产出更加优质的酶制剂。而且随着原生质体技术的出现,原生质体诱变被广泛应用于菌株的选育。原生质体是脱除了细胞壁的细胞, 具有细胞全能性及很强的细胞壁再生能力,是很理想的诱变材料。 本课题正是针对在分解壳聚糖酶源菌种的选育过程中

21、通过常规的筛选获得的菌株品质往往不尽如人意,因此有必要在已获得的优良菌种基础上,对其改良,以便获得更加优良菌种,提高壳聚糖的分解效率。1材料与方法 1.1 材料1.1.1 样品烟色曲霉菌种一支，由武汉生物工程学院酶工程实验室提供。1.1.2 实验试剂(NH4)2SO4（AR），天津市博迪化工有限公司；K2HPO4（AR），天津南开化工厂；NaCl（AR），天津市北方天医化学试剂厂KH2PO4（AR），湘中地质实验研究所；MgSO47H2O（AR）、MnSO47H2O（AR）、FeSO47H2O（AR），洛阳市化学试剂厂；琼脂（BR）、葡萄糖（AR）、蛋白胨（BR），天津市科密欧化学试剂有限公司

22、；壳聚糖，济南海得贝海洋生物工程有限公司；冰醋酸（AR），天津市博迪化工有限公司；NaNO3（AR）、KCl（AR），天津市北方天医化学试剂厂。1.1.3 酶纤维素酶（AR），北京辉宏德业生物科技有限公司；蜗牛酶（AR），北京辉宏德业生物科技有限公司。1.1.4 仪器与设备电子天平（BS124S），北京赛多利斯仪器系统有限公司；海尔电冰箱（BCD206T XZ），青岛海尔股份有限公司；冷冻超速离心机（GL16 G），上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计（SP2101UVPC），上海光谱仪器有限公司；电热恒温干燥箱（202OB），天津市泰斯特仪器有限公司；霉菌培养箱（MJX250B），天津市泰斯特

23、仪器有限公司；恒温摇床（HQ 45Z），武汉中科科技有限责任公司；恒温水浴锅（DK981），天津市泰斯特仪器有限公司；显微镜（TS-B），广州启跃光电仪器有限公司；血球计数板（TQAK），上海泛柯生化试剂有限公司；净化工作台（JHTDSC），济南康宝净化设备有限责任公司；高压灭菌锅（YX 280B），上海三申医疗器械有限公司。1.1.5 培养基平板培养基6(%)：壳聚糖 1.0，(NH4)2SO4 0.50，K2HPO4 0.20，NaCl 0.50，MgSO47H2O 0.10，琼脂 2.0，pH7.0。斜面培养基：组分配方同平板培养基。菌丝生长培养基7(%)：蛋白胨 0.30，葡萄糖 1.

24、50，MgSO47H2O 0.05，MnSO47H2O 0.003，FeSO47H2O 0.003，pH5.5。再生培养基(%)10：葡萄糖4.0，NaNO3 0.30， MgSO47H2O 0.05，FeSO47H2O 0.001， K2HPO4 0.01，自然pH。上培养基均用蒸馏水配制，0.1 MPa灭菌20 min。1.2 实验方法1.2.1 筛选育种过程实验室提供菌种诱变前分解壳聚糖能力检测孢子悬液的制备制备原生质体原生质体的紫外诱变及再生高产菌株的检出1.2.2 出发菌株烟色曲霉分解壳聚糖能力检测将烟色曲霉菌种活化，挑取单菌落接于平板培养基，于30 培养箱中培养23 d。肉眼观察平

25、板培养基上长出菌落周围是否出现透明圈，记录产生透明圈和菌落形态特征，测量透明圈的直径大小。挑取比值较大者进行分离纯化，于斜面培养基上进行纯培养，以供单因子实验选用。1.2.3 酶液的配制 配制0.7 mol/L NaCl溶液，称取纤维素酶1000 mg、蜗牛酶400 mg，用200 mL NaCl溶液溶解，充分振荡30 min，冷冻离心(4000 r/min，4 )15 min，留上清液待用。1.2.4 孢子悬液的制备将培养活化菌株的新鲜斜面加入适量的无菌水，刮下菌株的孢子于三角烧瓶中，玻璃珠充分振荡30 min，8层无菌纱布过滤菌丝体，收集液体即为孢子悬液，用显微镜观察血球计数板计算所得孢子

26、悬液的单位个数。1.2.5 制备原生质体 用无菌水将所得孢子悬液稀释至 104-105个/mL，将纯化的菌种斜面加入适量的无菌水，吸取1 ml孢子悬液接入盛有50 ml菌丝生长培养基的250 mL三角烧瓶中，置于30 ，150 r/min恒温摇床上摇瓶培养一定时间。摇瓶培养悬液在4000 r/min离心10 min，弃去上清液，再用0.7 mol/L NaCl溶液反复离心2次洗涤菌丝球，每5 ml菌悬液加入2 mL纤维素酶、蜗牛酶混合，在一定温度下恒温水浴一定时间，间或震荡，酶解停止后4000 r/min离心10 min除去未完全消化的菌体碎片，用0.7 mol/L NaCl溶液反复离心洗涤3

27、次，收集原生质体悬于NaCl溶液中，制得原生质体悬液用血球计数板数。1.2.6 原生质体的紫外诱变及再生使用0.7 mol/L NaCl溶液调整原生质体的浓度为106 个/mL，吸取原生质体悬液10 ml，置于直径6 cm的无菌平皿中，在距离15 w的紫外灯30 cm处进行照射，照射时间为90 s，红光下吸取照射后的原生质体悬液0.5 ml涂于再生培养基上，于30 培养箱中培养23 d。1.2.7 高产菌株的检出从再生培养基中挑取单菌落点接种到平板培养基中，由于平板培养基是以壳聚糖为唯一碳源，可通过记录产生透明圈和菌落形态特征，测量透明圈的直径大小来判断烟色曲霉产壳聚糖酶的能力11，并与出发菌

28、种产酶能力进行比较。根据此现象挑选高活力的菌株进行摇瓶发酵。 2 结果和分析2.1 烟色曲霉原生质体制备培养条件优化2.1.1菌龄对原生质体产率的影响 将活化后的出发菌体分别接入灭菌的菌丝培养基中，于30 、150 r/min条件下培养16 h、17 h、18 h、19 h、20 h，分别离心后收集菌丝球进行酶解反应，用显微镜血球计数板计数，实验结果见表1和图1。微生物生理状态是决定原生质体产率的主要因素之一13，图1表明，菌龄明显地影响原生质体的产率。随着培养时间的不同，菌体原生质体的产率也不同，处于对数生长期的菌体更容易酶解生成原生质体。当培养时间达到18 h时，原生质体的得率达到5.01

29、06个/mL，因此确定菌龄为18 h。表1菌龄对原生质体产率的影响菌龄/h原生质体数量（个/mL）162.2106173.5106185.0106194.7106204.0106 图1 菌龄对原生质体产率的影响2.1.2 酶液pH对原生质体产率的影响用pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲溶液配制纤维素酶、蜗牛酶混合酶液。将活化后的出发菌体分别接入灭菌的菌丝培养基中，于30 、150 r/min条件下培养18 h，离心后收集菌丝球再32 条件下用不同pH的酶液进行酶解反应，酶解作用时间为3 h，酶解后用显微镜血球计数板计数，实验结果见表2和图2。图2表明，酶液的pH值也可以直接

30、影响到原生质体的制备，因为只有在最适pH值时，酶的活性才最高，酶促反应速率才最大。根据酶液pH的不同，菌体原生质体的产率也不同。当酶液的pH为5.0时，烟色曲霉原生质体的得率达6.1106个/mL。因此pH确定5.0。表2酶液pH对原生质体产率的影响酶作用pH原生质体数量（个/mL）3.02.81064.03.21065.06.11066.04.41067.03.7106 图2 酶液pH对原生质体产率的影响2.1.3 酶作用温度对原生质体产率的影响 取培养18 h的菌丝体，在pH为5.0的纤维素酶、蜗牛酶混合酶液作用下，分别在26 、28、30 、32 、34 下各酶解3 h，用显微镜血球计数

31、板计数，实验结果见表3和图3。图3可知，酶解温度过高或过低对原生质体的产率都有影响，30 为酶解的最适反应温度。表3 酶作用温度对原生质体产率的影响酶解温度/原生质体数量（个/mL）262.3106283.1106305.7106324.6106344.1106 图3 酶作用温度对原生质体产率的影响2.1.4 酶作用时间对原生质体产率的影响 将活化后的出发菌体分别接入灭菌的菌丝培养基中，于30 、150 r/min条件下培养18 h，在pH为5.0的纤维素酶、蜗牛酶混合酶液作用下，30 下各酶解1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，用显微镜血球计数板计数，实验结果见表4和图4。图

32、4表明，酶解时间对原生质体的产率影响明显。在酶解时间小于2.0 h时，菌丝体未完全酶解，原生质体的产率随时间延长而增加。当大于2.5 h时，菌丝体酶解完全，形成的原生质体因酶解时间过长发生破裂，导致数量开始减少。故选2.5 h作为酶解的最适时间。表4 酶作用时间对原生质体产率的影响酶解时间/h原生质体数量（个/mL）1.51.21062.04.61062.55.51063.04.61063.54.3106 图4 酶作用时间对原生质体产率的影响2.2 原生质体紫外照射剂量的确定为了能够确定合适的原生质体紫外诱变照射时间，对紫外线照射时间与致死率的关系做了实验，其结果如图5所示。图5可知，原生质体

33、的致死率和紫外线的照射时间成正比关系，即照射时间越长致死率越高。根据育种工作者长期的研究和实践经验，一般认为致死率以90%99%效果较好。有报道认为致死率高，在单位存活细胞中负突变多，但在不多的正突变株中可能筛选到产量提高幅度大的突变株。故选用致死率为92% 的照射时间90 s12作为照射剂量对出发菌株进行诱变。 图5 紫外线照射时间对原生质体的致死率2.3 紫外诱变结果将诱变菌株再生后平板培养基上透明圈的直径大小进行统计。并且将诱变前后透明圈的直径大小关系做了比较，其结果如表5所示。表5 诱变时间与诱变前后透明圈直径的关系平板编号出发菌种透明圈直径/cm诱变后透明圈直径/cm透明圈增长幅度1

34、2.152.110.9822.152.231.0432.152.411.1242.152.651.2352.152.561.1962.152.030.9472.152.331.0882.152.451.14表5可以看出，虽然诱变前后透明圈直径的变化并非严格线性相关，但趋势不变，诱变后绝大部分透明圈直径大于诱变前，即原生质体的紫外诱变提高了烟色曲霉分解壳聚糖的能力。3 结论本试验中，烟色曲霉的原生质体制备的最佳条件是：采用在液体培养条件下培养18 h的菌丝，用pH为5.0的混合酶液蜗牛酶、纤维素酶14同时处理菌丝，在30 酶解2.5 h，用 0.7 mol/L的氯化钠为渗稳剂，此时原生质体形成数

35、可达到6.5106个/mL。经过90 s紫外诱变后，涂布再生后分解壳聚糖的能力增加，比出发菌株提高了1.23倍。实验结果表明,通过对烟色曲霉原生质体直接进行紫外诱变育种,对改良菌种特性具有良好的效果。参考文献1 钱志伟，杨丹丹，方尚玲，李小强, 陈茂彬.酯化红曲霉原生质体制备及紫外线诱变育种J.酿酒，2009，36（6）4750.2 李秀珍，杨平平，王燕.黑曲霉原生质体诱变育种技术研究进展J.中国酿造,2007 , 12：15.3潘力，李立风，彭昶，叶燕锐，王斌.酱油曲霉孢子原生质体的制备与紫外诱变育种J.食品与发酵工业，2006，32（8）：14.4王燕.双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体

36、制备的研究J.中国酿造,2007，5：1922.5方祥年，杜昱光，黄秀梨，等球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质J菌物系统，2002，21(1)：77-836Yoon H G，Kim H Y，Lim Y H，et a1Identification of essential amino acid residues for catalytic activity and thermostability of novel chitosauase by site directed mutagenesisJAppl Microbiol Biotechnol，2001，56：173-1807张卫兵，甘伯中，李

37、帆，郭爱莲.产植酸酶黑曲霉Px原生质体的制备与再生J.中国饲料,2010,18：3941.8朱萍，梁海秋，张弘，周河治.黑曲霉N i-5k 原生质体的制备和再生J.广西农业生物科学,2005.24（4）：339342.9郭鲁宏，杨顺楷.黑曲霉单宁酶高活性菌株的诱变选育J.微生物学通报，2007，27（2）：105108.10王春丽，武改红，陈畅，陈树林.黑曲霉原生质体诱变选育-葡萄糖苷酶高产菌株J.生物工程学报,2009,25(12)：19211926.11李秀珍，薄泉，杨平平，王燕.利用原生质体诱变筛选植酸酶高产菌株J.饲料工业,2007，28（8）：2729.12彭益强，贺淹才，全成恒，苏

38、丽政.用原生质体诱变选育高植酸酶活的黑曲霉变异株J.微生物学杂志,2002，22（5）:711.13罗杰，张云开，朱婧，石君连，陈桂光，梁智群.原生质体诱变选育-葡聚糖酶高产菌株J.食品科技,2010，35（5）：1518.14麻成金，黄群，傅伟昌，陈功锡，谭玉芳.红曲霉紫外诱变选育及其发酵特性研究J.食品科学,2009，19181.15吴爱祥.固态发酵黑曲霉产壳聚糖酶的纯化及其性质研究J.华西药学杂志,2010，25(1)106108.致 谢本论文是在指导老师周念波老师和武汉生物工程学院酶实验室实验员梅老师等数位老师的悉心指导、大力支持下完成的。在论文的选题、资料搜集、实验方向的选择、实验时间的安排以及论文的最后撰写等过程中，周老师都给予了我许多意见和帮助。实验期间梅老师、王老师两位实验员在试剂、仪器提供上给予了我极大的方便。在论文完成之际，我衷心的感谢周念波老师、梅老师等数位老师对我的关心和帮助。同时感谢陈凡、高阳等数位同学在实验期间和生活中的支持和帮助，以及深深的感谢我的家人对我大学学习期间的默默支持。最后，祝愿所有2012届毕业班的同学与全体教师身体健康，万事如意！ 张尚昆2012年5月于武汉