毕业论文终稿.doc

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1、2012届本科毕业论文（设计）放线菌的分类方法姓 名: _ _商玉龙_系 别:_ 生命科学学院_专 业：_ 生物工程_学 号：_ 080913021_ _指导教师：_ 宋兆齐_ _2012年5 月9日目 录摘要11 放线菌的分类研究意义与方法21.1放线菌22放线菌的分类方法的发展历程与意义32.1形态学与培养特征上的分类与鉴定32.2数值分类方法32.3化学分类33 放线菌的分子生物学分类的发展情况43.1.DNA碱基组成分析：43.2.DNA-DNA同源性分析：43.3.DNA-rRNA同源性分析：53.4.核酸的一级结构的分析：53.5.16S rRNA基因序列分析：53.7.PCR-R

2、FLP分析：53.8.rep-PCR指纹分析技术：63.9.RAPD分析：63.10.AFLP指纹分析技术：64放线菌的分类在未来发展的方向及意义6参考文献7致谢8放线菌的分类方法商玉龙 指导教师：宋兆齐(商丘师范学院生命科学系，河南 商丘 476000)摘 要：放线菌是原核生物的一个类群，相关分类学经历了早期的形态学上的经典分类（主要从其形态结构来进行分类），数值分类（运用计算科学与技术对放线菌进行描述分类），化学分类（运用化学分析的方法对放线菌的细胞壁和组成成分进行分析归类），直至今天的分子分类。通过对放线菌的分类进而建成系统进化树，更加方便了放线菌的研究与应用。由于科学进步的发展放线菌在

3、分子分类中又有了不同的研究方法，由（G+C）mol%的差别而分析的物种亲缘关系的远近形成的DNA碱基组成分析发展到在DNA杂交中的DNA序列互补程度来推断它们的的DNA-DNA同源性分析，从核酸的一级结构上的分析到RNA的二级结构上的分析等方法。由于PCR技术的发展限制性酶切片段长度多态性分析和对DNA片段上的基因分析技术使放线菌的分类更加简易与精确，从而发展出了rep-PCR指纹分析技术，随机扩增的多行性DNA分析，扩增性片段长度多态性分析等方法。每种方法都有着不同的优缺点，科技也在不停地进步所以放线菌的分类方法的研究还在继续的发展中。关键词：放线菌;分类方法;原核生物;系统进化树Class

4、ification of actinomycetes on the molecular levelSHANG yulong Supervisor: SONG zhaoqi(Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)Abstract: Actinomycetes is a group of prokaryotes, Related taxonomy experienced the earlier classic classification of taxonomic morphol

5、ogy(mainly from its shape and structure to classify), numerical classification (using the computer science and technology to describe the classification), chemical classification (using chemical analysis method to cell wall and components were analyzed classified), until todays molecular taxonomy th

6、rough to the classification of the system were built and evolutionary tree, more convenient actinomyces due to the scientific research and application of the development of the progress in molecular classification and were a different research methods, from (G + C) mol % difference and analysis of t

7、he species of genetic relationship of the formation of the near and far DNA base composition analysis to the DNA sequence in DNA hybrid complementary degree to infer the their DNA-DNA,From the primary structure of nucleic acids on the analysis to the secondary structure of RNA analysis method of PCR

8、 because development restriction enzymes cut fragment length polymorphism analysis of DNA fragments and the gene analysis technology makes the classification more simple and were accurate, which developed the rep-PCR fingerprint analysis technology, and the random amplified line sexual DNA analysis,

9、 amplification sex fragment length polymorphism analysis methods .Each method has its different advantages and disadvantages, and science and technology are constantly progressing so the research of actinomyces classification method is developing constantly.Key words: Actinomycetes; sorting techniqu

10、e; Prokaryotes; Phylogenetic tree 随着科技的发展放线菌分类学已从形态学与生化层面发展到了分子水平，在人们的研究中起着重要的作用。分子生物学的分类在现今正在蓬勃的发展，由于科技的发展、生物技术的日趋完善，对放线菌的分类研究方法更加的成熟，分类方法的研究也趋于不同。1 放线菌的分类研究意义与方法1.1放线菌放线菌（Actinomycete）是原核生物的一个类群。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。自从Waks

11、man和Vmezwa揭示放线菌用途的多样性以后，人们对放线菌的用途给予了更多的关注，在越来越多的科技人员的研究攻关下越来越多的放线菌被人们所发现。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生1-3。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，通过研究把放线菌合理的运用于人类科学的发展，对人们

12、的健康生活改善疾病治疗特别是对肿瘤的抑制的研究现在有了新的发展，在农业上对农作物的病虫害的治疗也有着不可替代的作用。并且有些放线菌代谢产物可以用于发酵、食品等很多行业，所以放线菌的研究对人们来说是有着重大意义的，其中放线菌的分类鉴定对放线菌研究与运用上有着很大的意义。早期的研究方法以依形态为主，根据其形态和形状的不同进行分类随后随着科学的发展化学的分类方法走进人们的视线。在80年代Stackebrandt与Woese4构建了放线菌的系统进化树开始，使放线菌的分类学进入分子分类时代。现如今分子分类随着科技的发展开始了多相分类系统。随着科技的发展放线菌基于形态学与生化方面的分类已经不能满足于人们对

13、科研的需求。人们需要更加精确的分类研究方式，而分子生物学的分类方式更能满足需求，在人们的研究中起着重要的作用。分子生物学的分类在现今正在蓬勃的发展。在国内外的放线菌研究中，不断发现新的种类，所以放线菌的分子分类也在不断的研究中，另外我国在微生物的研究中还有许多不足，在分类上还没有在国际上提出相应的新理论，由于放线菌的种类是未知的所以相应的分类方法也需要进行总结创新。2放线菌的分类方法的发展历程与意义从Cohn发现放线菌至今已有100多年了，Harz最早的描述了放线菌但首次称为放线菌却在Waksman等在1916年提出的，最后又在1961年Waksman5发表了放线菌的属和分类鉴定和描述这本书才

14、标志着放线菌的分类学的形成。传统分类也称描述分类，主要以形态与培养特征及理化特征等为指征，对微生物分类单位进行的描述分类：2.1形态学与培养特征上的分类与鉴定主要有基内菌丝的颜色与形状是否断裂形成横隔和是否产生色素等。气生菌丝的颜色和孢子丝的链的形状位置颜色和长短。产生的孢子方式以及孢子的形状数目大小结构特征等也为其经典分类的指标。2.2数值分类方法数值方法6的分类是在二十世纪中期应用计算数学的原理来进行对微生物的分类的，它是集体性的分类，分类后可以用于菌种的鉴定，该方法可以对众多菌株进行大型表行数据的比较分析，可以运用计算机和数学方法进行处理，而使结果在分类学和分类单元的建立上都是客观明确的

15、可重复的，其不足是性状比较多费时费力，而且不同的实验结果有一定差异无法进行交流比较，但是由于其能提供具体的表型性状鉴定特征，所以在放线菌的分类上有着广泛的应用。2.3化学分类化学分类是利用化学方法对放线菌的化学成分以及部分组成等进行分析进而形成分类。化学分类是在1956年被Cummins和Harris7最早指出的，直到1971年Lechevalier8夫妇发表了主要依据化学指标的分类系统使放线菌的分类进入化学分类阶段并被广大学者认可。化学分类主要依据细胞壁和全细胞的化学分析：细胞壁的组成成份：主要由中性多糖、肽聚糖和磷壁酸交联形成枝菌酸分类：枝菌酸的存在与否和分子特性是诺卡氏菌类放线菌的分类不

16、可少的指标根据碳原子数分为四类约含三十个的棒状杆菌；约四十个的红球菌枝菌酸；约六十个的诺卡氏枝菌酸；约八十个的分枝杆菌酸。磷酸类脂分类：磷酸类脂是组成细胞膜的成分，属于极性脂，具有分类学意义的磷酸类脂有四种分别为磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甲基乙醇胺具有很重要的鉴别依据。醌分类：醌在细菌的细胞膜上有泛醌和甲基萘醌。在革兰氏阳性的放线菌中只含有甲基萘醌，甲基萘醌的多烯侧链的长度和3位碳原子上多烯侧链的氢饱和度用于放线菌的分类鉴定具有很大的作用，分析醌的方法主要有高压液相色谱法和薄板层析法等。全细胞蛋白SDS-PAGE分析：SDS-PAGE是通过分析蛋白图谱在高度标准化的培养下来进

17、行分群和比较大量的相近菌株的方法。此外还有核糖体蛋白双向凝胶电泳分析和脂肪酸分类法等。为放线菌的分类提供了重要条件。3 放线菌的分子生物学分类的发展情况现今分类学随着科学的进步发展和分子生物学、细胞工程、基因工程遗传学等相结合并根据现在的生物信息学使放线菌的分类进入了新的一页即放线菌的分子生物学分类。放线菌的生物学分子分类的标志是1981年的Stackebrandt9和Woese10根据16S rRNA的相似性、DNA-rRNA和DNA-DNA杂交的结果描绘了放线菌和其他生物之间的系统发育树。随着生物学的发展放线菌在分子生物学中的分类起着越来越重要的作用。3.1.DNA碱基组成分析：由于每一种

18、生物的DNA中含有特定的（G+C）mol%，（G+C）mol%的差别与生物之间的物种亲缘关系的远近有很大的联系差别愈小亲缘关系愈近，而且（G+C）mol%不受环境与年龄的限制，现在许多微生物的（G+C）mol%已经被测定原核生物分为高（G+C）mol%群和低（G+C）mol%群。由于放线菌的种类太多而放线菌的（G+C）mol%变化量的范围较为狭窄所以以（G+C）mol%为精确地分类方法是不可能的，它只可以作为分析不确定的分类单元但是（G+C）mol%作为分类指标中有着非常重要的作用。放线菌的（G+C）mol%测定所用的方法主要为热变性法、高效液相层析法和浮力密度法11等。3.2.DNA-DNA

19、同源性分析：生物的遗传物质是DNA或RNA，DNA携带有大量的信息，但是对大量的DNA进行全序列分析要求非常高但现在已经实现我们也可以从DNA在DNA杂交中的DNA序列互补程度来推断它们的同源性。从二十世纪六十年代Doty等建立测定核苷酸序列的相似性技术，随后的Schildkraut最先用杂交法测定了不同细菌DNA间碱基序列的相似性，后成为了微生物分类鉴定的一种重要的方法成为了新建菌种的重要依据。DNA杂交的原理为双链DNA经过热变性形成单链DNA然后经过低温(低于Tm25)，处理互补的DNA就会复性成为双链的DNA而非互补的链仍旧为单链，而不是所有的单链DNA能全部互补成为双链。进行DNA-

20、DNA杂交的方法主要有液相杂交（液相复性速率杂交12、S1核酸酶法等）和固相杂交13(光敏生物素标记法、地高辛标记法等)。3.3.DNA-rRNA同源性分析：由于rRNA存在于原核的生物细胞，其中作为蛋白质的合成场所功能稳定并且由于rRNA有高度的保守区和可变区组成分子序列随着进化变化缓慢。这表明rRNA在分类上比DNA-DNA同源性分析具有一定的优势。DNA-DNA杂交是在种与亚种之间的区别分类鉴定而DNA-rRNA可以反映出属与属以上的分类信息。3.4.核酸的一级结构的分析：在核酸的一级结构中，由于16S rRNA具有保守性在进化中不容易变化，并且它的长度约为1540bp，结构长短适中易于

21、检测和分析所以成为了鉴定放线菌属种的分子基础。16-23S的进化速率比16S大10倍，虽然其序列容易被检测14但是由于其不同拷贝连中的大小不易区分所以需要采取方法进行鉴别。3.5.16S rRNA基因序列分析：16S rRNA是生物合成蛋白质的关键装置是最古老的分子之一，因其分子大小约1.5kb便于扩增和测序也保留了大量的信息，所以16S rRNA目前被认定为研究分子遗传学与细菌之间亲缘关系的最好材料。16S rRNA的基因序列分为恒定区和可变区，其中的恒定区序列基本保守结合PCR技术可将16S rRNA序列扩增出来再利用可变区序列的差异对放线菌进行分类鉴定。具体的步骤是先提取DNA，利用16

22、S rRNA通用引物PCR扩增出16S rRNA，取出一半进行跑胶测试纯度与大小一般1500bp为目的基因然后把将目的基因连接到T载体上,应该注意记得所用T载体的分子量大小，一般3000bp左右。连接后将整个连接体导入大肠杆菌细胞感受态细胞，养感受态细胞16或18小时，提取其质粒，然后将质粒拿出一部分跑胶。酶切所提取的质粒，以得到目的基因。然后开始凝胶电泳得到16S rRNA进行序列分析对比建立系统树对比其同源性进行分析3.6.RNA的二级结构分析:RNA的二级结构模型比一级结构更具有保守性和分类特征，所以现今16S rRNA的二级结构已经被用于放线菌的分类学中，进行属种甚至更高级别的分类研究

23、15-17但由于科技的发展还没有成熟RNA的二级结构还没有被研究清楚所以还没有被研究人员普遍认可。3.7.PCR-RFLP分析：RFLP即限制性酶切片段长度多态性分析。由于在生物进化中限制性核酸内切酶的识别位点发生改变，使同种生物的不同个体的DNA分子的酶切产生不同的酶切片段在电泳时呈现不同的条带，一般适用于2-3种菌的比较，但由于限制性内切核酸酶的消化作用，使条带在背景下难以辨清，随着科技的发展把RELP技术与PCR技术结合起来对PCR产物进行RFLP分析后，可弥补单纯的RFLP分析时的结果不清楚的缺陷。3.8.rep-PCR指纹分析技术：rep-PCR指纹分析技术又称重复片段PCR基因指纹

24、分析技术，它是根据放线菌的染色体上的高度保守重复的基因片段的互补引物，然后进行PCR电泳分析后对放线菌进行种以下的分类，这种方法在鉴定时方便快捷所以用于放线菌的有关属的分类上有恨重要的意义18。3.9.RAPD分析：RAPD分析即随机扩增的多行性DNA分析，是对扩增产物（用单个随机挂核苷酸序列引物对DNA进行扩增）长度的多态性分析的方法该法，可用于对种以下水平的分类研究。具有简单方便可直接有RAPD所提供的基因组进行分析但条件严格,任何一个碱基的改变都可能导致图谱变化19。3.10.AFLP指纹分析技术：AFLP是指扩增性片段长度多态性分析，采用一对限制性内切酶消化DNA并以产物为模板添加选择

25、性引物得到上述图谱20这种技术已经被证明在病原菌的鉴定分类上有作用21。这种方法适用范围广分辨率和稳定率都非常高，但操作复杂由于基因组上酶切位点的变化，使其在相关领域上的应用不是十分广泛。4放线菌的分类在未来发展的方向及意义放线菌自发现已来在人们的生活中起着越来越重要的作用，特别是抗生素的生产上，但是由于科技的发展人们研究放线菌的时间不是很长，对于其分类研究上由经典分类，数值分类直到现今的分子分类研究才经过一百多年的时间，但人们对其的研究非常努力随着科技的发展，放线菌的分类随着科学技术水平的提高而提高，在国际上大量的菌种保藏中心被建立最出色的是德国的国家菌种保藏中心(DSMZ)，中国也建有云南

26、大学微生物研究所放线菌实验室、中国科学院微生物研究实验室。但是科技在发展越来越多的放线菌的新种被发现新的分类单位也在变化而旧的分类系统由于不精确需要改进更新。随着PCR技术、电泳技术、图谱分析技术、DNA探针技术、分离技术等的发展。放线菌的分类学可以与它们相结合探索出新的分类技术方法。随着科研的不断深，大规模的测序技术的发展入放线菌的分类从多相分类学发展到了基因组系统学。而Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea（GEBA）计划的出现标志着分类学跨入了基因组学研究时代。基因组学的研究是选取具有特殊系统发育地位的放线菌进行全基因组测序而分析方法有序

27、列分析和全基因组特性分析法。全基因组特性的分析法在放线菌中的应用主要有基因顺序、基因内容和核酸短串来构建系统进化树。基因组系统发育学是分类学在基因时代与基因组学的完好组合借助这种方法使人们对放线菌的分类和各个单元之间的进化关系更加明确，属内分枝关系更加精确。全基因组序列学的研究在未来放线菌分类的研究中如同人类的基因组计划有着很重要的意义。参考文献1钱存柔,黄仪秀,林稚兰,等.微生物的分离与纯化技术M.北京:北京大学出版社,1999.68-69.2徐成勇,袁野.选择性分离放线菌J.无锡轻工大学学报:食品与生物技术,1999,18(2):45-49.3安德荣,史遂校,等.土壤放线菌分离中抑制剂的应

28、用研究J.西北农业学报,2002,11(1):106-108.4Stackebrandt E,Rainey FA,Ward-rainey NL.Proposal for new hierarchic classification system,actinobacteria classis novJ.International journal of systernatic bacteriology,1997,47(2):479-491.5Waksman S A.The actinomycetes classification,identification and descriptions of

29、genera and speciesM.Baltimore:The Villiams and Wilkins Co. 1961,1-363.6马迪根,马丁克,帕 克.微生物生物学M.杨文博,译.北京:科学出版社,2004. 7Cummins C S and Harris H. The chemical composition of Mycobacteria and NocardiaJ.Am Rev Res P Dis, 1956,92:63-72.8Lechevalier H A,Lechevalier M P,Gerber N N. Chemical composition as a cri

30、terion in the classification of ActionmycetesJ.Adv Appl Microbiol, 1971,14:47-72.9 Stackebrandt E,Woese C R. Towards a phylogeny of the actinomycetes and related organismsJ.Current Micobiology, 1981,5:197-202.10Woese C R,Kandler O,Wheelis M L.Towards a natural system of organisms:Proposal for the do

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32、A hybridization from renaturation ratesJ.Eur J Biochem,1970,12(1):133-142.14Gao P,Han Y,Xu G,et al.Fluorescence-based multiplex PCR-Single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis of 16S ribosomal DNA using capillary electrophoresisJ.Microbiol Immunol,2004,2(2):93-98.15Chen C,Zhao S,Ben K.Ph

33、ylogenetic analysis of the family Thermaceae with an emphasis on signature position and secondary structure of 16S rRNAJ.FEMS Microbiol Lett,2003,221(2):293-298.16 Sokolova T G,Gonzalez J M,Kostrikina N A,et al.Thermosinus carboxydivorans gen.nov.,sp.nov.,a new anaerobic,thermophilic,carbon-monoxide

34、-oxidizing,hydrogenogenic bacterium from a hot pool of Yellowstone National ParkJ.Int J Syst Evol Microbiol,2004,54(6):2353-2359.17Butler M K,John A.Fuerst Comparative analysis of ribonuclease P RNA of the planctomycetesJ.Int J Syst Evol Microbiol,2004,54(4):1333-1344.18张建丽,刘志恒.链霉菌的rep-PCR基因指纹分析J.微生

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36、性方面的应用J.生物技术,2003,13(5):42-43.21Velappan N,Sondgrass J L,Hakovirta J R,et al.Rapid identification of pathogenic bacteria by single-enzyme amplified fragment length polymorophism analysis J.Diagnostic Mcicrobiology and Infections Disease,2001,39(2):77-83.致谢：本论文是在宋兆齐老师的悉心指导下完成的，从研究方案的确定、论文开题、文献查找宋老师都给予我很大的帮助，而且在工作之余不辞辛苦的指导和批阅，并在论文的写作中给予许多周密的指导和建设性建议，在论文的修改期间细心地帮我查找错误这几个月以来，宋老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向宋老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。另外，我还要特别感谢邹艳美师姐对我实验技术上的指导和帮助。她为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。同时实验室各位老师也时常帮助我，在此我也衷心的感谢他们。最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢。谢谢大家对我的帮助。