毕业论文(答辩定稿王萍)2[1].doc

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1、分类号 Q939 学 号 2006116060 硕士学位论文培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响及两株新菌的初步鉴定王 萍指导教师 曹慧 副教授 专业名称 微生物学 研究方向 环境微生物工程 答辩日期 2009年06月 Effect of Cultivation Methods on Soil Bacterial Diversity by PCR-RFLP Analysis and Preliminary Identification of Two Novel StrainsBy Wang PingSupervised by Associate Prof. Cao Hui A Disserta

2、tion Submitted to Nanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements for Master DegreeCompleted in June, 2009 Commencement in June, 2009原 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结

3、果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。（请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年 月 日目 录摘要IABSTRACTIII符号与缩略语说明VII前言IX第一章 文献综述1一、土壤微生物的多样性

4、1二、土壤微生物多样性的研究方法4三、未培养微生物的研究进展12四、微生物分类鉴定的研究方法17参考文献20第二章 培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响291 材料与方法292 结 果333 讨 论38参考文献40第三章 Phycicoccus sp. TR6-7的初步鉴定431 材料与方法432 结果与分析503 结果讨论56参考文献58第四章 Humihabitans sp. TR6-11的初步鉴定612 结果与分析623 结果讨论66参考文献68全文总结71创新之处73附录 I 攻读硕士学位期间发表的论文73附录II 文中所用的培养基和试剂配方75致 谢77培养方法对土壤可培养细菌多样性

5、的影响及两株新菌的初步鉴定摘要提高土壤微生物的可培养性，获得纯培养微生物菌株，是微生物生态学研究的基础。目前由于技术手段的限制，以及人类认识水平的不足，使得自然界中微生物总数的99%还难以用纯培养技术获得分离和培养。因此研究和开发这99%的未培养微生物已成为国内外的一个热点。本论文采用三种营养物质浓度不同的培养基对土壤细菌进行分时段计数，以细菌通用引物扩增细菌16S rDNA片段，用限制性内切酶Hha I酶切PCR产物，对酶切图谱进行分型，研究了不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响；本论文还对从土壤中分离得到的两株与其相邻菌种具有较大差别的新菌株（标记为TR6-7和TR6-11）进行了初

6、步鉴定。结果表明，LB、CSEA、WSA培养基192 h后每g干土获得的细菌数量分别为14.84107、10.27107和6.91107 CFU，但微生物多样性指数以WSA为最高，LB多样性指数最低；三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性，LB和CSEA培养基间的Jaccard指数为57.69%，LB和WSA培养基之间为53.13%，而CSEA和WSA培养基的相似性指数达66.67%；96192 h细菌的丰富度最高，048 h细菌丰富度最低，并且三种培养基中单一OTUs类型的43.9%均是在96 h后才出现的。16S rDNA测序结果表明，所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于-和-变形杆

7、菌以及放线菌亚门，其中某些OTUs中的16S rDNA序列与Burkholderiaceae bacterium、Rhodococcus和Mycobacterium属具有较高的同源性，推测其细胞能够分泌复苏促进因子，有效地提高土壤细菌的可培养性。TR6-7革兰氏染色反应呈阳性，细胞形态呈椭圆状，无鞭毛和菌毛；最适生长温度为30，最适pH值为6.08，最适的盐浓度为2%，无Nacl等盐离子依赖性。TR6-7菌株不能使明胶液化，不能使淀粉水解， V.P.实验为阴性，不能使甲基红变红，不产生氨气，不产生吲哚，但能产生H2S，能使过氧化氢溶液产生小气泡，能使硝酸盐还原。TR6-7能利用蔗糖、半乳糖、果

8、糖、麦牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖为唯一碳源生长，但不利用甘露醇和甜醇。TR6-7的主要脂肪酸为C22:1 w7c/22:3 w3c。TR6-7的16S rDNA序列与其最相邻Phycicoccus dokdonensis KCTC 19248T的同源性为97.2%。基于以上数据我们初步鉴定菌株TR6-7属于Phycicoccus属的一个新种，并命名为Phycicoccus sp. TR6-7。TR6-11革兰氏染色反应呈阳性，细胞形态呈长杆状，无鞭毛和菌毛，无运动能力，好氧；在GPM、NA培养基上长势良好，最适生长温度为30，最适的盐浓度为0.5%，

9、无Nacl等盐离子依赖性，最适pH值为6. 8。V.P.实验为阴性，不能使甲基红变红，不产生氨气，不产生吲哚，不能水解Tweens40，80，但能水解Tweens20。TR6-11能产生H2S，能使明胶液化，能使淀粉水解，能使过氧化氢溶液产生小气泡，能使硝酸盐还原。能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麦牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖、甘露醇、甜醇、鼠李糖为唯一碳源生长。TR6-11的主要脂肪酸为C22:1 w7c/22:3 w3c，C24:2 w6c。TR6-11的16S rDNA序列与最其相邻的Humihabitans NRRL B-24470 T同源性为97.

10、1%。基于以上数据我们初步鉴定菌株TR6-11属于Humihabitans属的一个新种，并命名为Humihabitans sp. TR6-11。关键词: 微生物多样性；可培养性；培养基；培养时间；鉴定EFFECT OF CULTIVATION METHODS ON BACTERIAL DIVERSITY BY PCR-RFLP ANALYSIS AND PRELIMINARYIDENTIFICATION ON TWO STRAINSABSTRACTImproving the culturability of soil microorganisms and isolating pure stra

11、ins are the bases of the study of microbial ecology. At present, because of the limitation of technical means and the inadequate of humans knowledge level, 99% of the microorganisms in nature have not be cultured and isolated by traditional pure culture technique, so studies and developments are foc

12、used on the 99% of uncultured microorganisms at home and abroad. In this research, three culturing media were used for time-interval counting of soil bacteria. Bacterial universal primers were used to amplify 16S rDNA fragments; PCR products digested by restriction endonucleases Hha I and their fing

13、erprints analyzed for influence of culturing methods on soil microbial diversity and culturability. Two novel bacteria strains showed big difference were tentatively identified, the two novel bacteria strains designed TR6-7 and TR6-11 were isolated from soil.Results indicate that the number of bacte

14、ria grown in media LB, CSEA and WSA was 14.84107, 10.27107 and 6.91107 CFU per gram dry soil, respectively, after 192 h of incubation. The diversity index of soil bacteria was the highest in WSA, while the lowest in LB. Certain similarity was discovered in bacteria community between the three media,

15、 i.e. the Jaccard index was 57.69% between LB and CSEA, 53.13% between LB and WSA and 66.67% between CSEA and WSA. The richness of soil bacteria was the highest between 96 h and 192 h, while the lowest between 0 and 48 h, 43.9% of the single OTUs in three culturing media appeared after 96 h. Phyloge

16、netic analysis suggests that the dominant bacterial groups in the soil belong to -Proteobacteria,-Proteobacteria and Actinobacteria. The sequence of 16S rDNA of some OTUs was found to have high homology with Burkholderiaceae bacterium, Rhodococcus and Mycobacterium, so it is presumed that the cells

17、of these bacteria can secrete Resuscitation-Promoting Factors, which may effectively improve culturability of soil microorganisms. TR6-7 cells were Gram-positive, non-motile and Elliptic. Experiments showed that the optimum growth temperature is 30, the optimum growth pH is 6.08, the optimum salt co

18、ncentration is 2% and it showed better growth without Nacl. Starch, gelatin were not hydrolyzed. Indole, Methyl red and Voges-Proskauertests were negative. H2S were produced, but not Ammonia Gas. Nitrate is reduced. Catalase cativity was present. Sucrose, D-galactose, D-Fructose, maltose, sorbitol,

19、L-arabinose, raffinose, ribose, lactose, mannose, inositol, D-glucose, D-xylose are assimilated, but D-mannitol and dulcitol are not. The major fatty acids is C22:1 w7c/22:3 w3c. 16S rDNA gene sequence analysis revealed that this strain is closely related to Phycicoccus dokdonensis KCTC 19248T, with

20、 a similarity of 97.2 %. Based on these data, TR6-7 was assigned to a new species of Phycicoccus genus, for which a new name Phycicoccus sp. TR6-7. TR6-11 cells were Gram-positive, aerobic, non-motile and long-rods. Colonies could formed greatly in GPM or NA agar. Experiments showed that the optimum

21、 growth temperature is 30, the optimum growth pH is 6.8, the optimum salt concentration is 0.5% and it showed better growth without Nacl. Indole, Methyl red and Voges-Proskauertests were negative. Starch, gelatin, Tweens20 were hydrolyzed, but not Tweens40, 80. H2S were produced, but not Ammonia Gas

22、. Catalase cativity was present. Nitrate is reduced. Sucrose, D-galactose, D-Fructose, maltose, sorbitol, L-arabinose, raffinose, ribose, lactose, mannose, inositol, D-glucose, D-xylose, D-mannitol and dulcitol are utilized. The major fatty acids are C22:1 w7c/22:3 w3c and C24:2 w6c. 16S rDNA gene s

23、equence analysis revealed that this strain is closely related to Humihabitans NRRL B-24470 T, with a similarity of 97.1 %. Based on these data, TR6-11 was tentatively identified as a new species of Humihabitans genus, for which a new name Humihabitans sp. TR6-11.KEYWORDS: Microbial diversity; Cultur

24、ability; Culture media; Incubation time;Identification符号与缩略语说明PCR（polymerase chain reaction） 聚合酶链式反应Amp (ampicillin) 氨苄青霉素SDS (sodium dodecyl sulfate) 十二烷基硫酸钠PAGE (polyacrylamide gel eletrophoresis) 聚丙烯酰胺凝胶电泳Acry (acrylamide) 丙烯酰胺Bis (N,N-methylenebisacrylamide) N,N亚甲双丙烯酰胺APs (ammonium persulfate) 过

25、硫酸铵TEMED (N,N,N,N-tetra methyl ethylene diamine) N,N,N,N-四甲基乙二胺CFU（colony-forming unit） 菌落形成单位GC (Gas Chromatography) 气相色谱SEM (Scan Electron Microscopy)扫描电子显微镜OD (Optical Density) 光密度前言可培养技术是环境微生物多样性研究中一个极其重要的组成部分。但是大量的不可培养的微生物是传统方法最大的弊端。因此，导致了土壤微生物多样性的生态学研究一直处于较低水平。近年来分子生物学研究技术等非可培养技术迅速发展，极大地推动了自然界

26、功能微生物资源的开发和利用，给微生物生态学的研究带来了光明的前景，如RFLP， ALFP， RAPD和DGGE等方法已经被应用于土壤微生物多样性的研究并表现出很大的优势，结果更趋于真实，大量未被认知的微生物新物种及其新功能得到鉴定和应用。但是这些方法不以获取微生物活体细胞为目的，对这些细菌类群的形态、生理代谢、遗传和生态功能等方面的知识难以通过实验研究而是仅靠推测获得，所以仍没有克服微生物不可培养所导致的根本弊端。可培养性本身不是细菌细胞的特性。在一定程度上，微生物能否被培养取决于是否找到了适宜的培养方法，也有报道认为在某些环境甚至70%左右的细胞是可以培养的。本研究在传统微生物纯培养技术的基

27、础上进行了改进，阐明培养基类型对土壤可培养细菌群落结构的影响，揭示培养时间对土壤可培养细菌数量与多样性之间的关系。籍此筛选出一种获得更多土壤细菌数量、更高土壤细菌多样性的培养方法，为土壤微生物资源挖掘、开发新的活性物质奠定科学基础。本研究有以下3个内容：1 培养基类型对土壤细菌可培养和多样性的影响2 培养时间对土壤细菌可培养和多样性的影响3 对筛选分离的新菌的初步鉴定第一章 文献综述一、土壤微生物的多样性1、土壤微生物多样性的重要性土壤生态系统是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础1，对全球环境变化有着深远的影响。土壤微生物群落是土壤中的活性组分，包括细菌、真菌、放线菌和原生动物、病毒和小

28、型藻类2。每克土壤中栖息着大约100亿个微生物3，但在显微镜下观察到的微生物不到1%可以培养4。土壤微生物对全球生态系统功能如养分运转5、有机质分解、土壤结构维持、温室气体产生6、环境污染物净化7的调节发挥着重要作用。根据联合国粮农组织的统计，在氮素固定、有机废弃物处理、土壤形成、污染修复及农业害虫的生物防治等方面，全球农业土壤生物每年创造的总价值超过1542亿美元。正是由于土壤微生物在陆地生态系统中的重要性，有关土壤生物多样性的研究得到了广泛的重视。英国自然与环境委员会(Natural Environment Research Council, NERC)于1999年启动了土壤生物多样性研究

29、计划，该计划为期5a8。联合国粮农组织也启动了国际土壤生物多样性计划(Soil biodiversity initiative)，开展与土壤生物多样性的评价、管理和保护有关的基础和应用基础研究8 。2、土壤微生物多样性的概念土壤微生物多样性又称微生物群落结构，是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化9。它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。生物多样性还可以定义为生命的丰富度(richness of life)，通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一10。3、

30、土壤微生物多样性研究的内容生态系统是指各种生物与其周围环境所构成的自然综合体。在土壤生态系统中，土壤生物之间相互依赖、彼此制约，同时又与周围的环境因子相互作用、往复调控。因此我们认为，土壤微生物多样性研究的核心内容应是自然或干扰条件下土壤微生物的群落结构、种群消长、生理代谢、遗传变异及其演替规律，尤其是环境变更或管理分异条件下土壤质量的微生物学监测、评价与调控，及土壤微生物种质资源的开发与应用。土壤微生物多样性异常复杂，因为微生物对温度、pH、渗透压和大气压等的适应范围极广，土壤中任何一个能产生能量的生境往往均有微生物的存在11。因而，开展土壤微生物多样性研究技术难度较大、方法要求较高，当前主

31、要集中在物种多样性、遗传多样性、结构多样性及功能多样性等4个水平。3.1 土壤微生物的物种多样性土壤微生物的物种多样性是指一定区域内物种的多样性化及其变化，包括一定区域内生物区系的状况（如受威胁状况和特有性等）、形成、演化、分布格局及其维持机制等，这是微生物多样性的最直接表现形式。对于微生物而言，物种的分类鉴定存在着极大的困难，因而也就在很大程度上限制了微生物多样性的研究。首先微生物种的概念较模糊，至今还找不到一个公认的、明确的种的定义。这是因为微生物与高等生物不同，在高等生物中可用于定义种的几个主要性状，在微生物中无法使用，这是由于原核微生物本身的生理和形态特点决定的。其次，微生物的鉴定很难

32、。因为微生物形态简单、易变，不像动、植物那样有足够而又稳定的形状可用于分类鉴定，这也限制了物种多样性的研究。第三，研究方法的局限。1995年Amann等根据在原位、无培养的微生物系统发育学研究，认为地球上仅细菌就有1050万种，然而自然界中95%99%的微生物种群却因为当前研究方法的局限还未被分离培养和描述12。所以目前着重研究一些对人类关系最为密切的微生物种类，并通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。这就迫切要求人们在研究方法和研究技术上的进步。3.2 土壤微生物的遗传多样性土壤微生物的遗传多样性是指土壤微生物在基因水平上所携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这

33、是微生物多样性的本质和最终反映。与高等生物相比，微生物的多样性在基因水平上更为突出，不同种群间的遗传物质和基因表达具有很大的差异13。根据研究手段不同，微生物遗传多样性主要表现在基因组大小和基因数目的多样性、遗传物质化学组成和DNA序列的差异、rRNA基因序列的差异以及由基因序列所揭示的遗传背景多样性等方面。在微生物多样性研究中，人们最感兴趣的是小亚基RNA或其编码基因SSU rDNA。SSU rDNA包括保守区和变异区。保守区内核苷酸序列恒定，在分类上相距远的微生物分类群之间才有差异；变异区能够显示微生物分类种的差异；因而SSU rDNA被用于对微生物进行系谱分类。目前，人们对很多种已知微生

34、物的SSU rDNA/ rRNA序列进行了测序(大多数工作是对原核生物16S rDNA/ rRNA进行的)，并且建立了SSU rDNA/ rRNA序列数据库14。该数据库正在不断扩大，目前已有足够大的数据库对微生物进行系谱分类。3.3 土壤微生物的结构多样性土壤微生物的结构多样性是指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这也是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因。例如，微生物标记物分析法通过提取和分析微生物群落中可以用作不同类群标记性指纹的生化组分或胞外产物来获取微生物群落组成和结构多样性的信息15。因为不同菌群的特征谱图不同，在高度专一性基础上又具有多样性，所以标记物的组成变化

35、能够说明微生物群落结构的变化，进而对土壤微生物群落进行识别和定量描述。3.4 土壤微生物的功能多样性土壤微生物的功能多样性是指土壤微生物群落所能执行的功能范围和这些功能的执行过程，如分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等等，这些功能对土壤生态功能及自然界元素循环有着重要意义。土壤微生物多样性受制于土壤性质16，而微生物多样性又影响土壤功能多样性。土壤是微生物的生活场所，土壤的通气性、水分状况、养分状况以及有机质含量都直接影响着土壤微生物的种类和数量。土壤微生物能够利用土壤中的有机碳，其对有机碳的利用率是一项反映土壤质量的重要特征。若利用率越高，维持相同微生物生物量所需要的能源就越

36、少，说明土壤环境有利于土壤微生物的生长，土壤质量就比较高；土壤微生物具有提高土壤肥力的生态功能。Ovreas L用多种方法测定了土壤微生物后发现，富含有机质的土壤，其微生物多样性好于砂土17。生物多样性丰富的土壤，生态功能也呈现多样性，其生态系统和生产力均保持稳定18。目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性19。由于微生物具有多种多样的代谢方式和生理功能，所以可以适应各种不同的生态环境，并以不同的生活方式与其他生物相互作用，从而构成地球上丰富多彩的生态体系。4、土壤微生物多样性的生态系统服务功能微生物在生态系统乃至整个生物圈的能量流动和物质循环中都发挥着关键作用

37、。土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构、功能及过程，是维持土壤生产力的重要组分，也是评价自然或人为干扰引起土壤质量变化的重要指标。因而可以说，土壤微生物多样性的生态系统服务功能是其根本价值所在。本文着重从有机物分解、物质循环和生态安全调控等3个角度，简要的介绍了土壤微生物多样性的生态系统服务功能。4.1土壤微生物对有机物的分解作用微生物在生态系统中的最大价值是分解功能。绝大多数微生物作为异养生物，它们分解生物圈内存在的动物、植物和微生物的残体以及各种复杂有机物质，吸收一些分解产物，最终将有机物分解成简单的无机物，而这些无机物又可以被初级生产者利用，再次参与物质循环。特别是一些特殊物质，如腐殖

38、质、蜡和许多合成化学物质，只有微生物才能分解。若没有微生物，地球上的动植物残体将堆积如山，长期存留于人类生存的环境中，生物所需的各种营养元素终将消耗殆尽，人类社会势难世代绵延向前发展13。4.2土壤微生物在物质循环中的作用地球上大部分元素都以不同的循环速率参与生物地球化学循环。生命物质的主要组成元素(C、H、O、N、P、S)循环很快，少量元素(Mg、K、Na、卤族元素)和微量元素(Al、Co、Cr、Cu、Mo、Ni、Se、V、Zn)则循环缓慢。少(微)量元素中的Fe、Mn、Ca和Si则是例外， Fe和Mn以氧化还原的方式快速循环，但Ca和Si在原生质外的其他结构中含量则很高。C、N、P、S的循

39、环受2个主要的生物过程控制，一是光合生物对无机营养物的同化，二是后来进行的有机物的生物矿化。尽管所有生物都参与生物地球化学循环，但微生物在有机物的矿化中起决定性作用，例如地球上90%以上有机物的矿化均是由细菌和真菌完成的13。4.3土壤微生物的生态安全调控机能土壤质量是指土壤容纳和净化污染物质、维护和保障绿色植物生长以及满足人类其他合理需求的综合能力量度20，而土壤微生物在维护土壤健康、保障土壤可持续利用和调控生态安全等方面都发挥着重要的作用。例如，丰富而稳定的土壤微生物多样性有利于保持土壤肥力、防控土传病害、促进农业增产、保障产品质量21；另从直接生产生物质角度来看，某些土壤真菌的大型子实体

40、也可被食用或药用。其次，土壤微生物种质资源在修复污染环境方面也起着很重要的作用，特别在土壤修复、水体治理、固废处理过程中起着关键性作用，利用微生物分解有毒有害物质的生物修复技术被公认为治理大面积污染区域的一种有价值的方法。二、土壤微生物多样性的研究方法土壤微生物多样性研究方法多种多样，由传统的平板计数发展到BIOLOG系统分析再发展到分子水平，土壤微生物多样性的研究方法向着精确、方便、快速等方向发展，新的技术层出不穷。根据研究技术类型，土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：基于生物或化学的方法和基于现代分子生物学技术的方法14。分子生物学方法又可归纳为三方面：一是基于分子杂交技术的分子标

41、记法，可对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。二是基于PCR技术的研究方法，这些方法可以将极微量的DNA进行大量扩增，通过分析基因序列的特异性研究土壤微生物的多样性。三是基于DNA序列测定的研究方法，分析具体碱基序列的突变情况，与生物信息学结合，对数据比较分析，找出微生物多样性的遗传进化线索。1、生物或化学的研究方法1.1 传统的平板计数法平板计数法是利用一定的培养基和方法选择所特定的微生物，再根据各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。此方法不但简单易于掌握，而且在测定数量的同时可以分离出纯培养菌株，且可进一步做微生物组分分析。

42、传统的土壤生态系统中，微生物群落多样性及结构的分析大部分仅局限于从固体培养基上分离的微生物，随着人们对土壤中微生物原位生存环境的研究，发现这种传统的分离培养方法其实很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息22。纯培养方法和原理大多数是从研究有关医用微生物的方法中引用过来的，其实有些方法对土壤微生物研究并不适合。例如在自然土壤生态环境下，许多土壤微生物处于贫营养状态，而在实验室通常用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤活细菌的总数，因而大量的贫营养微生物不能生长，其测定结果误差大；实验室在分离培养土壤细菌时，通常只是在

43、28下培养，虽然土壤中存在高温型细菌，但土壤中的低温型细菌却被忽视了。由于传统的平板培养方法只能反应极少数微生物的信息，这些结果不但不能充分反映土壤微生物生态功能，而且还埋没了大量极有应用价值的微生物资源。所以传统的研究方法只能作为一种辅助手段，只有与其他先进方法结合起来时才能较为客观和全面的反映微生物群落结构的真实信息。但这种方法适合分离具有特定功能的特殊目标物种，利用该方法已获得许多应用价值的微生物种类，并应用于基因介导及生态恢复等方面。1.2 BIOLOG鉴定系统BIOLOG系统自从Garland和Miss于1991年建立起来后，广泛应用于评价土壤微生物群落的功能多样性:不同土壤类型23

44、 、不同植物物种下的土壤24 、不同管理策略下的农业土壤25, 26 和不同植被的根际土壤27。此方法是根据微生物对单一碳源底物的利用能力差异，当接种菌悬液时，其中一些孔中的营养物质被利用，使孔中的氧化反应指示剂四氯唑紫呈现不同程度的紫色，从而构成该微生物的特定指纹。经过BIOLOG系统配套软件分析，并与标准菌种的数据库比较之后，该菌株的分类地位便被确认出来。Biolog 法被用于多种病原微生物的鉴定和环境微生物群落的研究中。通过 Biolog 法进行环境微生物研究时无需分离培养纯种微生物，就可获得有关微生物群落总体活性与代谢功能的信息，最大限度地保留了微生物群落原来的代谢特征，且灵敏度高，分

45、辨力强，数据的读取与记录都可由计算机辅助完成。但BIOLOG只能反映少数适合在微平板(microplate)培养基上生长的微生物，即通过微生物群落对选择性培养基或刺激物的反应来测定代谢活性，所以不能反映实际状态28。另外由于培养环境的改变可能引起微生物对碳底物实际利用能力的改变而造成一定的误差，并且由于目前所拥有的标准数据库还不完善，所以有些种类还不能被准确鉴定。即使存在以上缺点，但由于可以快速、简便地获得大量土壤微生物群落结构和功能多样性方面的信息，仍被认为是一种较好的方法。1.3 磷脂脂肪酸（PLFA）分析磷酸脂肪酸是微生物结构的稳定组成成分，分析脂肪酸的种类及组成比例可鉴别土壤微生物的多

46、样性。磷脂脂肪酸图谱分析法的基本流程是:首先将磷脂脂肪酸全部提取出来，然后用气相色谱或气质联用进行分析，得出PLFA图谱29。群落的微生物结构发生变化，就可通过图谱的变化得到快速有效的监测。使用磷脂类化合物中的脂肪酸组成估价土壤微生物的群落结构是近几十年常用的一种生化方法。磷脂类化合物只存在于所有活细胞膜中，一旦生物细胞死亡， 细胞膜很快就被降解，磷脂脂肪酸会被迅速的代谢掉，生物中的磷脂类化合物能显示出一快速转换率，而且生物可以含有相对固定量以磷脂类化合物形式作为它们的生物量30。一些学者曾发现使用直接从土壤中提取的磷脂类化合物的量可准确地表达为土壤的微生物量31。磷脂类化合物的这些特征和磷脂类化合物与生物关系的密切性，决定了可用其作为土壤中微生物标志化合物的可能性，此外，脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。因此，许多研究者用包括土壤在内的环境样中可提取磷脂类化合物中的脂肪酸(PLFA)组成来直接估价其微生物的群落结构30, 31。PLFA方法虽然能跟踪研究微生物群落的动态变化，能快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸，但是也有其局限性。第一，他不能从种的水品上鉴定微生物，只能鉴定到属；第二，这种方法依赖于标记脂肪酸，标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计，因此操作过程需要十分小心谨慎，防止人为因素的