本科毕业设计土壤微生物宏基因的提取与分离技术的研究进展.doc

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1、四川师范大学本科毕业设计土壤微生物宏基因的提取与分离技术的研究进展学生姓名李涛院系名称生命科学学院专业名称生物技术班 级2009级1班学 号2009090123指导教师张尔亮四川师范大学教务处二一三年五月目录1 宏基因组及宏基因组学11.1 宏基因11.2 宏基因组学12 土壤宏基因组文库的筛选23 土壤宏基因组研究现状34 土壤宏基因组学的技术局限性45 土壤微生物总DNA的提取55.1 间接提取土壤微生物总DNA55.1.1 土壤分散65.1.2 土壤微生物的提取65.1.3 土壤微生物的纯化75.2 直接提取土壤微生物总DNA85.2.1 原位细胞裂解85.2.2 DNA提取和纯化96

2、提取DNA的纯度及效率检测107 小结108 展望11参考文献12土壤微生物宏基因的提取与分离技术的研究进展学生：李涛 指导老师：张尔亮摘要：本文综述了土壤微生物宏基因及宏基应组学,并对宏基因组的构建及土壤宏基因组的筛选和土壤宏基因组的研究现状进行了相关介绍,本文重点是对土壤宏基因组学的技术局限性及土壤微生物多样性研究中总基因（DNA）分离与提取技术的研究进展进行了详细介绍，并分析了基因（DNA）提取过程中的主要影响因素及存在的问题。关键词：土壤微生物 土壤宏基因组学 提取技术 研究进展 局限性 多样性 DNA Advances of total DNA extraction technolo

3、gy for soil microbial diversity researchStudent: Li Tao Tutor:Zhang ErliangAbstract：The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. applying appropriate methods to extract microorg

4、anism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level,and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method土壤微生物宏基因的

5、提取与分离技术的研究进展土壤是各种微生物生活的大本营，据估计1g土壤中有40007000种近10亿的细菌，生物量可达300kgha 30000kgha1。土壤微生物的研究曾一度仅限于一少部分可培养的微生物。实际上，许多环境样品中的优势菌株都是不可培养的，通过培养方法估计的土壤微生物多样性只占总量的0112。因此土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义3。1 宏基因组及宏基因组学1.1 宏基因宏基因组是1998年Handelsman等首次提出的概念4。它一种以环境样

6、品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系、及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。1.2 宏基因组学宏基因组学源于20世纪70年代土壤微生物基因组DNA的直接提取技术的实现，随着微生物学和生物技术的不断发展，Handelsman于1998年提出了宏基因组学的概念4。宏基因组学又叫群体基因组学（Community Genomics）环境基因组学（Environmental Genomics）或环境基因组学（Environmental Genomics），定义：利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中

7、的有机体群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。生物学和化学的结合孕育了宏基因组学的诞生，宏基因组学的发展需要最大限度的利用现代生物技术和实用筛选技术。图1 土壤微生物宏基因组构建及筛选步骤2 土壤宏基因组文库的筛选 宏基因文库的筛选主要有功能驱动筛选、化合物结构水平的筛选、序列驱动筛选，底物诱导基因表达筛选。功能驱动筛选是根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可以发现全新的基因或活性物质，利用该方法已成功分离了一些降解酶、抗生素抗性和抗生素编码基因在工业上有很多重要的酶就是用这种方法发现的5,6,7。通常采用一些简单的活性筛选方法，在固体培养基中加入化学染料和酶的不溶性或含发色团底物衍生 物来

8、检测单克隆的酶活。例如，在含有三油酸甘油酯和荧光染料罗丹明B的培养基上筛选脂肪水解酶克隆8。化合物结构水平的筛选是根据不同结构的物质在色谱中有不同的峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。此方法工作量大，费用高。序列驱动筛选是不依赖重组基因在宿主中表达来筛选，而是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过杂交进行筛选具有目标序列的克隆子。主要有两种方法：一种是根据已知保守序列设计引物或探针。通过PCR或杂交来筛选目的克隆，这一策略只限于分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因，如聚酮合成酶 ；另一种方法是对含有16S rRN

9、A等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序9,10。该方法可以拓宽对一些序列信息了解比较少的微生物的研究，例如利用16S rRNA序列分析发现了酸杆菌门的许多新成员11。Schloss等开发了一种可以对16S rRNA文库进行统计分析的软件一LIBSHUFF，利用该软件可以发现不同微生物群落间的差异，可用于微生物生态学的研究12。底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选，这种方法已经成功的从宏基因中筛选出芳烃化合物诱导的基因。国内外的资料显示这4种筛选方法可以筛选到所需要的物质，但筛选效率低，费用高。3 土壤宏基因组研究现状利用宏基因组学的技术，科研人员筛选到了许多

10、功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E13；Courtois等利用柯斯载体构建了含5 000个克隆子的环境基因组文库，采用PCR 序列分析的方法，筛选出编码聚酮合成酶的新基因，同时采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物，两者互为同分异构体；Yun等选用pUC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，利用活性筛选方法，从30 000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。 2005年，LimHK等以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了森林土壤的宏基因组文库，筛

11、选到2个具有抗菌活性的克隆，对其结构进行分析，得出其中一个为产红色色素的靛玉红，另一个为产蓝色色素的靛蓝，是靛玉红的异构体。2006年，VogetS等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质，证实了其具有较广的pH值和温度适应范围，并且在较高的盐度时也具有活性，具有工业应用价值。4 土壤宏基因组学的技术局限性 总DNA提取技术尚存在一定的限制，土壤环境中，由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因，从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量DNA。Bertrand等采用间接提取法，通过Nycodenz梯度离心，所回收的土壤DNA片段大小己能达到400kb

12、p，但至今基于原位裂解获得100kbp土壤DNA的提取技术尚未突破，运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库（现有的土壤宏基因组文库中，平均插人片段最大为44.5kb）仍是一个难点。不可避免地，环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏，表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。 阳性克隆筛选频率低是宏基因组学的另一个瓶颈所在，运用经典的功能筛选方式，往往是在数千个，甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆，造成此局面一个重要的原因是外源基因的异源表

13、达水平低下。目前根据核酸序列相似性及基因保守区设计探针或引物的杂交、PCR筛选方法，从文库中发现新基因的比率尚不到已知基因的40%。 环境微生物宏基因组研究能让我们发现存在于不可培养微生物中的一些重要的生理过程。许多实验室已经开始努力从不可培养土壤生物的基因组序列中去获得重要的基因，特别是从Acidobacterium组中，因为它是土壤中最常见的细菌。这些数据提供了关于这些生物在土壤中扮演角色的线索。随着足够序列信息的获得，这些生物的代谢途径将被构建出来，引导我们采取有效的策略去培养这些生物。这些数据也将准许我们构建包含所有已知开放阅读框的微生物芯片，来确定这些基因在时间和空间上的表达状况。

14、尽管宏基因组技术本身还存在着一些局限性，但它为土壤微生物的研究提供了一种有效的研究策略，尤其是对于以上不能获得纯培养的土壤微生物来说，宏基因组学不仅是研究土壤微生物生态学的坚实基础，更是我们获得土壤中各种基因资源的一个有效手段。5 土壤微生物总DNA的提取 从土壤样品中提取DNA的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总DNA。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放DNA，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，

15、都存在一定的缺陷，要想提取较完整的DNA需要具备以下几个条件： 土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌DNA折断。采集土壤样品后应尽快提取DNA，因为土壤在4储藏几周就会造成大分子DNA的降解。5.1 间接提取土壤微生物总DNA Torsvik等14最先报道了从土壤中提取微生物DNA的间接法，包括以下4个步骤：分散土壤；土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；土壤微生物的纯化；细胞裂解及DNA纯化。具体方法简述(参考Be

16、rtrand 等方法有所改进25):称取1000g土样，加入1500mL预冷蒸馏水，搅拌混匀，双层纱布过滤后700 r/min，4 离心5min，收集上清；沉淀再经过两次重悬和离心，合并所有的上清，10000 r/min ，4离心10 min 后弃上清，沉淀用10 mL 0.8% NaCl重悬.将10 mL Nycodenz（Axis-Shield, Oslo, Norway; 8 g Nycodenz溶于10 mL 灭菌蒸馏水）加入土壤悬液底部，11000r/min，4离心30min.小心收集在Nycodenz土壤混合颗粒和上层水层分界面上的白色细胞层，重悬后在10 000 r/min 4

17、离心20 min 去除Nycodenz溶液.沉淀按照直接法提取DNA.5.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有winogradsky盐溶液、tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等

18、15。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放DNA很重要，处理不当会使DNA解。5.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 g/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6 g/

19、cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。hopkins等17采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 m或30 m微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。 由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。vilarino等16在前人研究的基础上提出了

20、分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 m）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等18以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10 te buffer中即可得到DNA，建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等19以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。5.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家 albertsson于20世纪50年代

21、所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛20。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是peg（聚乙二醇）/dextran（葡聚糖）系统和peg

22、/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同21。smith等19研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为41的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层peg相，土壤残存颗粒将进入下层dextran相，经4次提取纯化，富集在上层peg相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层peg相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等15用2%peg+ 6%dextran两相分离技术（a2pp）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%

23、胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。5.2 直接提取土壤微生物总DNA现在的土壤细菌DNA直接提取法是在ogram等23建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：原位细胞裂解；DNA提取和纯化。具体方法(参考周集中等方法略有改动24)：1000g 土样中加入13500 mL DNA提取缓冲液（100 mmol/L Tris, 100mmol/L EDTA，100mmol/LNa3PO4,1.5mol/LNaCl,1%CTAB,pH8.0），混匀后加入100uL蛋白酶K（25mg/mL）

24、和200uL溶菌酶（50 mg/mL,pH 8.0），37水浴 30min ,每隔 10min颠倒混匀.加入2 mL 20% SDS，65水浴 2h,每隔20min 颠倒混匀.8000 r/min室温离心15min ，取上清，用等体积氯仿抽提一次，水相中加入0.6倍体积的异丙醇4沉淀过夜，11000r/min 4离心20 min收集DNA沉淀，70%乙醇漂洗两次，干燥后用100Ul TE溶解.-20保存。5.2.1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂sds和s

25、arkosyi、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶k、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对DNA的提取效果较好。王啸波等26采用PBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物DNA和RNA，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等27采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，结果表明获得的DNA适合于酶解和PCR扩增要求。 值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理

26、状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的DNA具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等28采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（g+）DNA，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处理未对DNA造成大的剪切，提取的DNA片段还大于23.1 kb。张颖慧等29使用优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮

27、研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。5.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNF提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除DNA样品中的蛋白质和部分RNA，然后对DNA进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（peg）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（pvpp）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。lamontagne等30研究结果表明p

28、vp能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸杂质、提高DNA纯度的作用。李靖宇等31采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物DNA进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足PCR扩增。李钧敏等34用含pvpp的缓冲液预洗DNA样品，然后添加cacl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用peg8000沉淀DNA，可提高DNA质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于PCR分析的土壤微生物总DNA的提取方法。蔡刘体等35采用 sds-ctab法提取烟草病圃土壤微生物总DNA，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的质量。吴红萍等36

29、采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物DNA进行纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16s rDNA基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等37采用直接法提取土壤微生物总DNA，然后用sephadex g-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的DNA。段学军等38采用稀释模板及巢式PCR法很好地解决了在DNA提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等39将bio101 systems公司研制的fastprep多试管核酸提取系统与相应的fast DNA spinkit for soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总DNA。 事实上没有哪种单一的纯化步骤可以除

30、去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。smalla等40将粗提的DNA进行3步纯化：氯化铯密度梯度超速离心纯化；醋酸钾沉淀；geneclean纯化。发现经前2步纯化的DNA通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。6 提取DNA的纯度及效率检测32 33 40 411 目测 直接观察粗DNA样品颜色及洁净度. 2 电泳检测 3种粗DNA分别在0.8%琼脂糖常压电泳（150 V, 30 min ）和低电压电泳（25 V, 8 h）中进行检测 . 3 产率及腐殖酸的定量 用UV- 分光光度计测定3种粗DNA的

31、A260nm、A280nm、A230nm值，并分别计算A260nm/A280nm、A260nm/A230nm4 PCR扩增效率检测 PVP 处理和Nycodenz处理提取的粗DNA分别稀释50、100 、200 倍，用古菌通用引物扩增16SrDNA. 5 多样性对比分析 分别将PVP 处理和Nycodenz处理法提取的粗DNA进行低电压电泳（4, 25 V, 8 h），以回收后的纯化DNA样品为模板，分别采用细菌、古菌、放线菌及真菌的rDNA 特异性引物进行PCR 扩增.7 小结 从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注43。因而越过分离培养的步骤，直接从土

32、壤中获得总DNA以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总DNA。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的DNA提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。 间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的DNA质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分DNA的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，milko等44发现一种taq DNA聚

33、合酶基因突变型可增加对腐殖酸等pcr抑制物的抗性，不需要对基因组DNA进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。 绝大多数直接提取法提取的DNA片段长度不会超过23 kb，而DNA的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的DNA，直接提取法对此几乎无能为力。 在DNA提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用45。但近年来有研究表明DNA提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究46。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方

34、式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。 评价一种土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物DNA；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等47，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。8 展望目前，国内外对土壤微生物总DNA提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取DNA还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程

35、中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。参考文献1Torsvik V，Gokscyr J，Daae F LAppl Environ Microbiol，1990，56 (3)：782787 2Torsvik V，Daae F L，Sandaa R A，et Curr Opin Microbiol，2002，5：2402453肖艾和，张洪霞，谭周进，等.土壤微生物多样性研究的dgge/tgge技术进展j.核农学报，2009（4）：721-727.4 HANDELSMAN J，RON M DON R，BRADY SF，et al.Molecular biological acc

36、ess to the chemistry of unkown soil microbes：a new frontier for natural productsJ.Chen Biol，1998，5（10）：245-249.5Henne A，Daniel R，Schmitz R A，199965：39013907et alAppl Environ Microbiol，199965：390139076Martinez Aet O2Appl Environ Microbiol，2004，70：245224637Riesenfeld C S，Goodman R M，Handelsman J Envir

37、onmental Microbiology，2OO4，6：9819898Yun J，Kang S，Park S，et alAppl Environ Microbiol，2004，70:722972359Abulencia C B，Wyborski D L，Garcia J A，et al，Appl EnvironMicrobio12006，72：3291330110Beja 0，Aravind L，Koonin E V，et alScience，2000，289：1902 190611LilesMR，Manske B F，Bintrim S B，et a1Appl EnvironMicrobi

38、ol， 200369：2684269112Schloss P D，Larget，B R，Handelsman，J Appl Environ Microbiol，2004，70：5485549213 WANG GY，GRAZIANI E，WATERS B，et al.Novel natual products from soil DNA libraries Tn a streptonycete hostJ.Org Lett，2000（2）：2401-2404.14 torsvik v l，goksoyr j. determination of bacterial DNA in soilj. so

39、il biological and biochemistry，1978，10（1）：7-12.15 李妍，倪德军，胡红青，等.应用两相分离技术研究红壤微生物组成的探讨j.土壤学报，2007，44（1）：152-158.16 vilarino a，arinel j，schuepp h. extraction of vesicular arbuscular mycorrhizal mycelium from sand samplesj.soil biology and biochemistry，1993，25：99-110.17 hopkins d w，macnaughton s j，odonne

40、ll a g. a dispersion and differential centrifugation technique for representatively sampling microorganisms from soilj.soil biological and biochemistry，1990，23：117-225.18 潘力，崔翠，王斌.一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法j.微生物学报，2010，37（3）：450-453.19 吴敏娜，张惠文，李新宇，等.提取北方土壤真菌DNA的一种方法j.生态学杂志，2007，26（4）：611-616.20 raghava

41、rao k s m s，ranganathan t v，srinivas n d. aqueous two phase extractionan environmentally benign techniquej. clean technical environmental policy， 2003，5：136-141.21 向万胜，吴金水，肖和艾，等.土壤微生物的分离、提取与纯化研究进展j.应用生态学报，2003，14（3）：453-456.22 smith n c，stribley d p. a new approach to direct extraction of microorgan

42、ism from soila/ritz k，dighton j，giller k e. beyond the biomassm.london：british society of soil science， 1994.23 ogram a，sayler g s，barkay t. the extraction and purification of microbial DNA from sedimentsj. microbiol methods， 1987，7（2-3）：57-66.24 Zhou JZ, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils

43、 of diverse composition. Appl Environ Microbiol , 1996, 62 : 316-32225 Bertrand H, Poly F, Van VT, Lombard N, Nalin R, Vogel TM, Simonet P.High molecular weight DNA recovery from soils prerequisite for biotechnological metagenomic library construction. J Microbial Meth , 2005, 62 : 1-1126 王啸波，唐玉秋，王金

44、华.环境样品中DNA的分离纯化和文库构建j.微生物学报，2001，41（2）：133-140.27 熊开容，张智明，张敏.活性污泥DNA提取方法的研究j.生物技术，2005，15（4）：43-45.28 张瑞福，崔中利，曹慧，等.土壤微生物总DNA的提取和纯化j. 微生物学报，2003，43（2）：276.29 张颖慧，李明春，魏东盛，等.一种改进的丝状真菌 DNA 提取方法j. 微生物学通报，2008，35（3）：466-469.30 lamontagne m g，michel f c，holden p a， et al. evaluation of extraction and purif

45、ication methods for obtaining pcr-amplifiable DNA from compost for microbial community analysisj. journal of microbiological methods，2002，49（3）：255-264.31 李靖宇，赵吉，边玉，等. 湿地土壤微生物 DNA 提取及其脱腐技术j. 微生物学通报，2010，37（8）：1130-1137.32 yeates c，gillings m r，davison a d，et al. methods for microbial DNA extraction

46、from soil for pcr amplification j. biological procedures online，1998，1（1）：40-47.33 张于光，李迪强，王慧敏.用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法j.应用生态学报，2005，16（5）：956-960. 34 李钧敏，金则新.一种高效可直接用于pcr分析的土壤总微生物DNA抽提方法j.应用生态学报，2006，17（11）：2107-2111.35 蔡刘体，胡重怡，罗正友，等. sds-ctab法提取烟草病圃土壤微生物总DNAj. 江西农业学报，2011，23（2）：119-121.36 吴红萍，郑服丛.不同

47、环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化j.广西农业科学，2008，39（1）：21-61.37 朱立成，邹小明，蔡瑞玉.红壤中微生物总DNA的分离与纯化j.井冈山学院学报（自然科学版），2007，28（12）：5-7.38 段学军，闵航.镉胁迫下稻田土壤微生物基因多样性的dgge分子指纹分析j.环境科学，2004，25（6）：122-126.39 滕应，骆永明，赵祥伟.重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其pcr-dgge分析j.土壤学报，2004，41（3）：343-347.40 smalla k，cresswell n，mendoca-hagler l c， et al. rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplificationj. j applied b