《基因芯片技术》第8章-利用基因芯片进行差异表达基因分析课件.ppt

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1、基因芯片技术,Gene chip technology,内容提要：第一节 差异表达基因分析第二节 聚类分析第三节 主成分分析,第8章 利用基因芯片进行差异表达基因分析,第一节 差异表达基因分析,单张cDNA芯片差异表达基因,Aerobic 需氧Anaerobic不需氧,差异表达基因分析,基因表达谱芯片实验的主要目的之一是发现两个样本间差异表达基因。通常采用基因在实验组和对照组中信号的比值作为衡量基因在两种状态下基因的表达差异。在双色荧光系统中，用Cy5/Cy3的比值来衡量基因的表达差异，也称表达差异值。,差异表达基因分析,在Affymetrix等短的寡核苷酸芯片中，采用单色荧光标记的方式，实验

2、组和对照组分别用两张芯片进行检测，表达差异值即为两张芯片的信号比值。噪声和芯片本身的一些因素以及生物学本身的特点给筛选差异表达基因带来了很大的麻烦。必须设定一个差异表达基因的判定标准。这个筛选的标准就称为差异表达基因的阈值。,如何确定差异表达基因的阈值倍数法,优点：简单、直接。缺点：没有考虑差异表达的统计显著性。比如，在某个实验中，基因表达水平的变化不大，如果选择判别域值为2倍，则有可能找不到几个差异表达的基因，假阴性率比较高。但如果是主观缩小判断域值，又有可能增大假阳性率。,Z值法,在一张cDNA芯片上一般都点了很多基因，其实这些基因中只有一小部分表达有差异，所以一般都假设表达的比率值满足正

3、态分布。Z=(X-)/.|Z|=1.96在寡核苷酸芯片中，芯片上的基因在相应实验条件下或相应组织中也只有一小部分基因有表达，可以假定强度满足对数正态分布，同样可以对其作Z变换，使其具有统计意义。,Z值法,缺点：如果实验体系中没有一条差异表达的基因，Z值法还是会挑选出5的差异表达基因。这是因为在芯片实验中，总有一些由于背景噪声产生的假阳性点。如果实际上实验中有大量的基因表达发生改变，Z值法还是机械的找出5的差异表达基因，丢失了一部分真阳性点。,排秩统计量法,选择一个统计量给基因排秩（研究多，方法多）为排秩统计量选择一个阈值，在阈值之上的值将被认为是表达差异显著的值,重复芯片（replicates

4、）M值法,根据比率平均值或M值对基因排序。M值为信号强度比值的log2值，M杠是任一特定基因在重复序列中M值的均值。缺点：这一排序法忽略了一个基因在重复实验中的不同芯片上表达水平的差异程度。例如，可能某一个基因在某一张芯片上M值很大，但在其他芯片上M值很小，其实这条基因并没有差异表达，但由于个别M值的影响，从而显示出一个差异表达的特性，造成假阳性。,T值排序,假如一个基因在几张重复芯片的M值都很小，但是这些M值非常接近，所以s值也非常小，这样可能会导致t值很大，从而会把这个本没有差异表达的基因误认为差异表达。,修正的T值法,修正值由样本方差的均数和标准差估计而得。结果显示：在一个模拟的数据集中

5、，虽然带有一些经验性质，但用修正t-统计量给基因排秩比用均数和一般的t-统计量效果要好。,单通道寡核苷酸芯片差异基因（两个样本直接比较）,Affymetrix，illumina芯片由于有探针重复，可以利用统计方法计算出一个统计性的P值或者score值，筛选差异表达基因。,不同类样本差异基因识别,评价一组数的统计量,平均值 标准差,比较多组数的方法,T检验：平均值F检验：方差,SAM（significance analysis of microarrays）微阵列显著性分析,在单通道Oligo芯片中，尤其是affymetrix芯片数据分析中用得较多,双通道cDNA芯片数据分析用得较多,False

6、 Discovery Rate(FDR)错误发现率,统计学家都想用更符合统计学的手段得到差异基因，即通过假设检验后，赋予每个基因统计显著性或者P值，使得每个基因的判别更有统计学上的意义。为了达到这个目的，统计学家们常常用控制错误发现率（False Discovery Rate）的方法来判断差异基因。错误发现率是评估检验统计显著性的最有力工具之一。,Multiple test(P-value adjustment)多重检验（P-价值判断）,火山图（volcano plot）,Statistical test:P-value（统计检验：P值）Fold change:Ratio（折叠变换：比率）,其

7、他方法,B-statistics(Smyth,2004)Bayes T-test(Baldi and Long,2001)SAMROC(Broberg,2002)Zhao-Pan method(Zhao and Pan,2003),Improved Detection of Differentially Expressed Genes对差异表达基因的改良性观测 Time series microarray dataset 微阵列数据的时间序列,聚类：发现一些未知的细胞状态、疾病的亚型以及一些能识别这些样本状态的基因，或者说发现一类功能相似的基因或者一类有共同调控机制的基因。归类（分类）：基于已

8、有知识，并有改进现有知识的潜力，通过训练分类器来辨识与已知细胞状态或疾病亚型相类似的样本，或者是与已知的共调控基因表达相似的基因。,第二节 基因芯片聚类分析,分类(classification),分类(classification),样本分类情况已知分类基因选取分类准确性判断：准确率，相关性,层级聚类方法：,得到类似于进化分析的系统树图，具有相似表达谱的基因彼此临近，他们可能具有相似的功能。其重要思想是：先将n个样本看成n类，计算类间的距离，再将相似性最高的两类合并成为一个新类，得到n-1类，再重新计算关系矩阵，不断重复这个过程直至所有的基因融合成为一个,基因表达数据矩阵(Affymetrix

9、 GeneChip oligonucleotide arrays),Gene expression table X：log sam/ref intensitiesX0:gene is overexpressedX0:gene is underexpressed,基因表达数据矩阵(glass slides),Gene expression table X：log red/green intensitiesX0:gene is overexpressedX0:gene is underexpressed,数据矩阵具体形式,数据形式,对任意一个基因来说，样本值是特征值，数据的维数是M对任意一个样本来

10、说，基因值是特征值，数据的维数是N,数据矩阵,基因数远大于样品数。聚类时，考查基因间的相似性，从数学上讲就是看对应的M维数据之间的相似性。,Cluster&Treeview软件,Cluster&Treeview软件,Genesis软件,预分析（Pre-Analysis）,重复值合并（replicate handling）数据转换和标准化（data transformation and standardization）缺失数据处理（missing value management）基因筛选（pattern selection）,重复值合并,在特定条件下把所有的重复值合并成一个数值可能更为方便，而

11、这一个值是给定基因/条件的代表。通常的合并：计算这些重复值的集中趋势指标，如均数、中位数或众数。但是，使用一个集中趋势指标代替一组数值意味着信息的丢失，因此数据的合并应谨慎。去除奇异值：可以通过计算原始数据的均数和标准差，去除位于给定区间外的数据（如均数加减3个标准差外的数据）。剩余的数据重新计算均数和标准差，并消除给定区间外的数据。,重复值合并：,数据转换和标准化,数据变换的目的：在尽量保证原始数据特征不变的前提下，使变换后的数据更适于进行统计分析。对数转化（log-transformation）中心化处理（center）单位圆化正态化（均值为0，方差为1）,缺失数据处理,芯片上的某些点可能

12、因为芯片的缺陷、点像素强度达到饱和、点像素强度非常小等因素而产生异常的数据点，在数据的预处理阶段把这些数据点删除。未观测点若后续的统计分析要求数据满足完整性，如特征基因提取的奇异值分解、某些基因的聚类分析方法等，则需要对含有缺失值的数据进行处理 删除含有缺失值的整条记录，这种方法操作简单，但却因为个别值的缺失而删除整个记录，可能丢失大量有价值的信息 填充或修补缺失数据,缺失数据的处理,固定值法，比如0或者1行平均法使用重复数据点对缺失数据进行填充。对于生物学重复中缺失数据的填充应慎重，应当使用尽量同质的样品对缺失值进行估计。使用基因间的相关性对缺失数据进行填充。奇异值分解法，KNN法。其他方法

13、，最小二乘法拟合修补，方差迭代分析，最大可能性分析,缺失数据的处理方法KNN法,K最近邻法（K-nearest neighborhood method）：假定某个基因在某个指标上含有缺失值，计算含缺失值的基因与在该指标上无缺失的基因间的相似性指标。与该基因相似性最大的K个基因称为该基因的K个最近邻，这K个基因在该指标上的数据就是估计该基因缺失数据的基础，估计值可以是这K个基因在该指标上的均数，也可以是这K个基因的加权均数。在加权均数中，权重为上面计算的基因间的相似性。K值的确定具有一定的经验性，但不宜太大和太小。,基因筛选（gene selection）,在进行分析之前，要先选择用来分析的基因

14、。芯片中的基因有上万条，相应的数据矩阵也有上万行时，要预先进行基因的滤取，否则既会增加运算的难度，又会引入了不必要的基因，更增加了解释结果的难度。去掉无效基因，当某条基因在表达谱数据中的无效数据个数超过一定范围时，该基因就被认为是一条无效基因，在聚类分析中不考虑该基因。一条基因表达谱数据的波动很小，即数据的方差小于一定范围，意味着这条基因与所要研究的生物过程或对象关联很小，也可滤掉。,基因筛选,针对特别目的的基因筛选，如筛选不同类之间差异表达基因，常用假设检验的方法，比如t检验、F检验等。,发展,新算法,新角度,合并多种方法,第三节 主成分分析（Principle Component Anal

15、ysis，PCA）,不改变整体数据矩阵的数据结构，去除数据的冗余性，常用主成分分析法。,降维概述,降维：指将样本从输入空间通过线性或非线性映射到一个低维空间。,降维：将高维数据转换为易于处理的低维数据，减少了无用信息和冗余信息，减少了后续的计算量。当降至三维以下时，可以使用可视化技术，从而发挥人在低维空间感知上的优点，发现数据集的空间分布、聚类性质等结构特征。,主成分分析（PCA，principal component analysis）,对于一组原始随机变量为X1,Xp，寻找一个新的变量Z1，这个新的变量是原始变量的线性组合，Z1=a11X1+a21X2+ap1Xp，并使得Z1的变异最大化Z

16、1即为原始变量的最大主成分，它使用一个变量试图最大化地包含一组变量的变异。通常一个变量还不足够，因此，需要寻找第二个主成分Z2，Z2与Z1不相关，且是除Z1外具有最大方差的原始变量的线性组合。,主成分分析,本章小结:,确定两个基因表达是否有差异，需要确定一个阈值，超过这个值，两个基因表达就有差异。阈值的确定需要依赖很多数学算法，常用的有：倍数法、Z值法、排秩统计量法等。对于重复芯片的差异基因表达分析，常用方法有：M值法、T值排序法、P值检验等。聚类的目的是发现一些未知的细胞状态、疾病的亚型以及一些能识别这些样本状态的基因，或者说发现一类功能相似的基因或者一类有共同调控机制的基因。其中最常用的方

17、法是层级聚类，Cluster&Treeview是最常用的聚类分析软件之一。,本章小结:,在筛选差异表达基因时，先要对数据进行预分析，即对重复值进行合并、对数据进行转换和标准化处理，对缺失数据进行处理。预分析之后，才能进行基因筛选。如果想不改变整体数据矩阵的数据结构，并去除数据的冗余性，常用主成分分析法，其中最主要的思想是对数据进行降维处理。,思考题：,在分析两个基因表达是否有差异是，需要确定阈值，常用确定阈值的方法有哪些？优缺点是什么？聚类和分类的区别？什么是层级聚类？请简要介绍缺失数据的处理方法-KNN法？在筛选差异表达基因时，对数据进行预分析的主要步骤有哪些？主成分分析的主要思想是什么？,The End Thank you,