发酵专业论文.doc

《发酵专业论文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵专业论文.doc（23页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第二章 发酵工业菌种第一节 发酵工业菌种概述1、微生物的特性：有些微生物能在厌氧的条件下生长；有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长；有些微生物能进行复杂的代谢；有些微生物能利用较复杂的化合物；有些微生物能在极端的环境下生长2、工业化菌种的要求：能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；遗传性能要相对稳定；不易感染它种微生物或噬菌体；产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；生产特性要符合工艺要求3、抗生素生产有关的微生物放线菌（链霉素四环素；红霉素等） ；真菌（青霉素、头孢等）；一些产芽孢

2、的细菌；植物或动物来源4、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。5、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌6、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌：生长迅速、蛋白产量高;表达蛋白的纯化、分离及分析快速；外源基因的导入相对容易；已建立了整套表达理论及技术。(二) 真核细胞

3、表达系统：酵母(既是微生物又是真核细胞)：生长迅速，营养要求不高，易培养；安全性好；比哺乳动物细胞操作简单；具有一定的修饰蛋白的能力。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统：具有准确的转录后修饰功能；具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。第二节 发酵工业菌种的分离筛选1、菌种选择的总趋势：野生菌变异菌；自然选育代谢控制育种；诱发基因突变基因重组的定向育种

4、 2、分离筛选原理与技术：（1）筛选的两种指导思想先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选；分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。（2） 分离筛选工作在实际中应用的几个方面：从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株 ；从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性、指导性（3）新种分离筛选：菌种分离的一般过程：土样的采集 预处理富集培养 菌种分离菌种的初筛与复筛采样时要注意的问题：气候、水分、空气；来源要广；结合产

5、品的特点；标签：地点、时间、气候等富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。富集的三种方案：定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养；当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑；不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法定向培养的方法：（1）物理方法：加热、膜过滤等；但主要是通过培养的方法（2）分离方法的选择：根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特或生长特征独特选择性分离 无选择性特征根据产物的特征进行随机分离 （3）选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。 （4）选择性分离原理和技术：生长条

6、件的选择与控制原理（控制营养成分 、控制培养基酸碱度、添加抑制剂、控制培养温度、控制通气条件）+选择性分离技术（富集液体培养技术、固体培养技术）例如：固体培养技术常用于分离某些酶产生菌；选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质，通过直接平皿反应。如乳酸菌、淀粉酶等。随机分离原理与技术从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例：抗生素产生菌的筛选、生长因子产生菌的筛选、多糖产生菌的筛选 第三节 菌种改良1、 目的：提高目标产物的产量、提高目标产物的纯度，减少副产物、改良

7、菌种性状，改善发酵过程、改变生物合成途径，以获得高产的新产品 2、 方法：基因突变（自然选育、诱变育种）、基因重组（杂交、原生质体融合、基因工程）自然突变（菌种的分离纯化）：（1）有两种情况：一种表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变；另一种是对生产有利，这种突变成为正突变。（2）工业生产上的意义：自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。（3）回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降。（4）步骤：单细胞(孢子)悬液的制备；平板分离；挑选单菌落(注意形态的观察)；发酵试验诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛

8、选（1）诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂（物理：紫外，快中子；化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍）（2）诱变剂处理过程中几个有关的问题：化学诱变剂使用过程的安全性；诱变剂量的选择；诱变剂的选择；出发菌株的选择（3）、筛选的方法：随机筛选、形态、理性化筛选（从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。）结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。代谢设计育种（一）代谢设计育种的策划（1） 目的产物代谢途径的组合（五

9、段式）（2）中心代谢流上节点的分析（3） 理想载流途径的推定 （5） 五字策略的应用：进、通、节、堵、出（二）育种方案的实施（1） 出发菌种的选定：调节机制简单、遗传标记可靠、生长情况良好、有目的产物的生产潜力、可以获得、经费方面可行（2） 遗传操作方案的制定：物理诱变、化学诱变、复合诱变、定向诱变、插入基因拷贝、插入途径基因组（3） 遗传操作方案的实施：缺陷型突变株的获得（营养因子、酶和功能性蛋白质、营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株、酶缺损突变株、输送体系缺损突变株、条件突变株）、结构类似物抗性突变株的获得、 结构类似物超敏性突变株的获得、分子生物学方法、突变株的获得结构类似物（代谢撷颃物）的选

10、择：一、空间结构类似，二、对微生物有致死性或毒性（抑制生长）；绝大多数情况下，结构类似物可被其“真身”解毒。 三、有些抗生素、药物（包括中药）、诱变剂本身就是结构类似物（代谢撷颃物），但需确证。结构类似物抗性突变株的获得：结构类似物的确定；生长抑制试验和敏感性试验；“筛子”的设计；剂量的确定；筛选的具体方法的确定；高产株的检出（4）变异株培养条件的优化：尽量从生物学的角度安排试验；尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条件不一致带来的系统误差；每批摇瓶（生物）试验都要做对照；注重产量与菌体量之间的的微妙关系（生物机器的特殊性）代谢工程定义利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特

11、性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。又称作途径工程，是多基因的基因工程。发展基础代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。代谢工程育种思路改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻

12、断有害代谢产物的合成。（1）加速限速反应（2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。（3）构建代谢旁路（4）改变能量代谢途径扩展代谢途径 （1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。 （2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径: 为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。 2)构建新的代谢途径

13、: 利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。第四节 菌种保藏与复壮菌种保藏：1、保藏目的：使菌种不死亡，不生长，不污染，不降低或丧失其优良性，以尽量延长使用时间。2、原理：创造不利于菌种生长的一切条件，使其代谢处于休眠状态。（低温、无氧、干燥、缺营养）3、菌种保藏的方法：.斜面低温法斜面菌种置46冰箱中（36个月），简单、保存时间短，易污染及退化；穿刺保藏法1%软琼脂培养基，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处，覆盖2-3 mm无菌液体石蜡，冰箱，6-12个月；沙土管干燥保藏法载体：沙、土、沙 + 土、干燥、寡营养，适用于形成芽孢的细菌、

14、产生孢子的丝状真菌和放线菌；液体石蜡保藏法在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌液体石蜡，液面高出斜面1 cm，直立放置，延长保藏时间；真空冷冻干燥保藏法各保藏机构广泛采用的主要保藏方法，原理：创造干燥和低温的保藏环境，方法：在较低的温度下，将细胞冻结，并且保持细胞完整；然后在减压情况下使水分升华，获得干燥的菌体样品，特点：保藏期长（5年）、变异小、适用范围广，需要一定的设备，操作相对繁琐，技术要求较高；液氮超低温保藏法保藏效果好，方法简单，适用范围最广，原理：液氮的温度可达-196，此时菌种的代谢活动停止，化学作用亦随之消失，方法：将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管内，放到液氮罐内保藏

15、。菌种的复壮1、菌种的衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。表现：形态改变，生长慢，抗逆性差，产量及质量下降。根源：内因是菌种的遗传物质发生率负变异，外因是传代过多，条件不适宜2、防衰措施：保证菌种的纯培养；严格控制传代次数；用适宜菌龄的菌种；用适宜培养条件及保藏条件3、狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有的性状的相应措施。4、广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯种分离和生产性状的测定工

16、作，以期众中选择到自发的正变个体。5、复壮方法：纯种分离，通过寄主体进行复壮，淘汰已衰退的个体纯种分离：即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。分离方法：一是只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。另一类方法，可达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。通过寄主体进行复壮对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰退

17、现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。 淘汰已衰退的个体通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。第三章 发酵工业培养基设计 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用：满足菌体的生长/促进产物的形成发酵培养基的要求：培养基能够满足产物最经济的合成；发酵后所形成的副产物尽可能的少；培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，

18、便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应；所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。第一节 培养基的类型及功能按纯度：（1）合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定；适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律；培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产 （2）天然培养基: 采用天然原料，原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产 ；原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 按状态：（1）固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类；（2）半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为

19、0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。（3）液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。 按用途：孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种 第二节 发酵培养基的成分及来源 碳源：作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃工业上常用的糖类 葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应 糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，

20、但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1、无机氮源：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层

21、意义：满足菌体生长；稳定和调节发酵过程中的pH2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响3、氮源使用的一些相关问题：有机氮源和无机氮源应当混合使用；有些产物会受氮源的诱导和阻遏；有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力；无机盐及微量元素来源：C、N源，以盐的形式补充

22、使用注意点：对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑；使用时注意盐的形式（pH的变化）生长因子、前体和产物促进剂生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G-Na（MW356),需要多少苯乙酸(MW136) 1mg=1667u 解：青霉素6000*0

23、.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%补充：前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利；前体使用时普遍采用流加的方法，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%产物促进剂：指那些非细胞生长所必须的营养物，非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而

24、促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。水水源质量的主要考虑参数：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 第三节 发酵培养基的设计和优化一、培养基成分选择的原则：菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、合适的C、N比1000.22.0、pH的要求 二、成分含量的确定（一）、理论转化率与实际转化率 理论转化率：理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。 实际转化率：指实际发酵过程中转化率的大小 （二）、实验设计合理的实验方法：单因子实验、多因子实验（均匀设计、 正交实验设计、响应面分析等

25、。）三、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次：摇瓶培养基设计的第一步；反应器最终的优化的基础配方（摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大）摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵罐：反应器水平,可以得出最终优化的基础配方五、培养基设计时注意的一些相关问题 原料及设备的预处理；原材料的质量；发酵特性的影响

26、；灭菌补充：在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提 有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。 有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法 第四章 发酵工业的无菌技术第一节 染菌的防治1、概念：染菌：发酵过程中除了生产菌外，还有其他菌的生长繁殖染菌时间：指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。2、染菌的影响：造成大量原材料的浪费，

27、在经济上造成巨大损失；扰乱生产秩序，破坏生计划；遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性；影响产品外观及内在质量。3、染菌对发酵的影响：感染生产菌的正常代谢，降低产量；改变PH，降解某些产物；污染不同微生物，不同阶段染菌危害不同。4、不同时期染菌（1）种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌 发酵前期最易染菌，且危害最大，因为发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵

28、御杂菌能力弱。措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，

29、对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。5、发酵染菌对提炼和产品质量的影响（1）、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异（2）、发酵染菌对提炼的影响：过滤困难而大幅度降低过滤收率；有机溶剂萃取时发生乳化；离子交换树脂分离时，降低树脂的交换容量。6、染菌的原因（1）总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培

30、养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。（2）染菌原因： “明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。（3）染菌总结：设备渗漏或“死角”； 空气带菌；种子带菌；灭菌不彻底；技术管理不善7、染菌的检查与判断（1）染菌的检查：显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）、平板划线培养或斜面培养检查法（平板制好后，应先保温24小时，确定无菌）、肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）因为以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（1个/ml），所以他们未发现染菌，还不能肯定未被染菌；（2）种子培养和发酵的异常现象：种子培养异常（菌体生长缓慢、菌丝结团、代谢不正常）、发酵异常（菌体生长差、PH不正常

31、、溶解氧异常、泡沫过多、菌体浓度过低或过高）（3）发酵过程的异常现象来判断染菌：溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸）、排气中CO2异常显示染菌8、染菌情况分析：（1）单罐染菌：不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效（2）多罐染菌：系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底（3）前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底（4）中后期染菌：补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题9、染菌的防止（1）防止种子带菌：制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制；沙土制备时要多次间歇灭菌；

32、注意接种时的无菌操作；子瓶、母瓶的移种和培养；无菌室和摇床间都要保持清洁。（2）防止设备渗漏：试漏方法可采用水压试漏法。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用集气桶来试漏。（3）防止培养基灭菌不彻底：培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角

33、，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。（4）防止空气引起的染菌10、发酵染菌后的措施：发酵液必须经过灭菌后才放下水道；寻找染菌原因；染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒11、染噬菌体的防治（1）染噬菌体对发酵的影响：造成断种，无法生产（2）产生原因：活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源（3）染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入2030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。（4）噬菌体的防治：

34、建立工厂环境清洁卫生制度； 感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间；发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到；70800C杀死噬菌体，才可排放；环境用漂白粉消毒；选育抗噬菌体的菌种；第二节 发酵工业的无菌技术灭菌方法干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法 第三节、培养基及设备灭菌 （一）湿热灭菌原理1. 热阻：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k的倒数来表示 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线 （公式，自己抄）2、微生物热死定律（公式，自己抄）3. 灭菌温度和时间的选择 （公式，自己抄）4. 影响培养基灭菌的其它因素：培养基成分、泡沫、

35、pH、培养基中的微生物数量、培养基的物理状态（二）分批灭菌：将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，也叫做实罐灭菌。 1、灭菌过程：三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气2. 灭菌时间的估算：升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 (N/N0) =-kt来粗略估算灭菌所需时间（例题）例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2105个耐热

36、细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=401062105=81012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至100以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。（三）连续灭菌：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却然后进入到反应器的杀菌方法，又称连消。1、连续灭菌过程：（1）配料：配料罐用于培养基的配制（2）预热：预热桶的作

37、用一是定容，二是预热。预热的目的是使培养基在后续的加热过程中能快速地升温到指定的灭菌温度。7090（3）加热： 加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.450.8MPa，其目的是使培养基在较短的时间内快速升温。2、连续灭菌时间的估算 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。例2某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为131，原污染程度为每1ml含有2105个杂菌，已知131时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。解：C0=2105(个/ml) Ct

38、=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)= 2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37 min3、工艺：喷淋冷却连续灭菌流程、喷射加热连续灭菌流程、薄板式换热器连续灭菌流程（四）分批灭菌与连续灭菌的比较 连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不

39、彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。 第四节 空气除菌1、无菌空气：指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。2、发酵对空气无菌程度的要求：一般按染菌机率为10-3。来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。3、空气除菌的方法：辐射灭菌通常用于无菌室和医院手术室；加热灭菌；静电除菌常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用；过滤除菌绝对过滤、深层过滤4、过滤介质的过滤 / 分离效率由于：惯性撞击、扩散拦截、拦截截留、重力沉降、静电吸引的共同作用而增强 5：空气过滤除

40、菌流程概述：对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。深层通气发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。流程的设备：主设备：空气压缩机、空气过滤器；附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器流程的制订应考虑：地理、气候环境、设备条件（1）过滤系统：过滤系统由金属过滤器、预过滤器及蒸汽过滤器组成。预过滤器的作用是将空气前处理系统中的铁锈等杂物进行预滤。 蒸汽过滤器则是阻挡蒸气管路中的锈蚀物和锅炉污垢等杂质。上述二种过滤器的功能是保护金属过滤器，延长其使用寿命。 （2）膜过滤系统组成：蒸

41、汽过滤器、预过滤器（粗）、除菌过滤器（精）消毒问题：滤芯（器）消毒是一个日常操作工序。滤芯常见的消毒方法有蒸汽、热水和化学试剂消毒三种。蒸汽消毒要注意选择饱和蒸汽，一则是可以可靠杀死细菌，二则是可通过控制压力来调节温度。蒸汽消毒对于疏水滤芯来说相对是简单的，但对亲水滤芯特别是膜材料耐温度不高的滤芯来说，操作方法是至关重要的 （3）附属设备：粗过滤器作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷；空气贮罐作用：是消除压缩机排出空气量的脉动，维持稳定的空气压力，同时也可以利用重力沉降作用分离部分油雾；气液分离器；空气冷却器(4)空气除菌流程的分析空气除菌系统包括：冷却、分离

42、油水、加热、 过滤几种典型的设备流程:两级冷却、加热除菌流程；冷热空气直接混合式空气除菌流程；高效前置过滤空气除菌流程6、空气预处理（1）原理：除尘(外源空气的前处理)、降温、除油、除水、加热、稳压（2） 预处理流程设计的简繁关键：去湿问题（3）两级冷却、加热除菌能有效控制压缩空气的温度和相对湿度，几乎适用于各种条件的地区，特别是南方潮湿地区。（4）冷热空气直接混合式空气除菌特点：可省第二冷却分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量较少，利用压缩空气的热量来提高空气温度。适用于中等湿度地区。（5）利用热空气加热冷空气的流程示意图（6）高效前置过滤空气除菌流程特点：无菌程度高（7）提高

43、过滤除菌效率的措施：减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的 。降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。（8）空气压缩和压缩空气的冷却 第五章 种子扩大培养第一节 扩大培养目的与要求1、种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面

44、活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。2、种子扩培的目的：接种量的需要、菌种的驯化、缩短发酵时间、保证生产水平3、种子的要求：总量及浓度能满足要求、生理状况稳定，个体与群体、活力强，移种至发酵后，能够迅速生长、无杂菌污染、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力 第二节 种子制备的技术概要1、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般归为发酵车间管理，因此形象地称这些

45、培养过程为生产车间阶段。二、实验室阶段1、培养物选择的原则：对于不产孢子和芽孢的微生物获得一定数量和质量的菌体；对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子或获得一定数量和质量的菌丝体2、培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。3、起始接种物的传代问题：使菌种的传代次数尽可能的少细菌：保藏斜面 活化斜面产孢子：保藏 母斜面 子斜面孢子培养（培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月）：母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落

46、接种时密一点，得到大量的孢子。孢子三、生产车间阶段1、培养物的选择原则：此阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。缩短发酵时间，有利于获得好的发酵结果2、培养基选择的原则：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。原料不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，原因:一是成本二是驯化3、发酵级数的确定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。 确定依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困

47、难，一般2-4级。级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。4、接种量的确定接种量等于移入种子的体积与接种后培养液的体积之比。过大过小都不好，最终以实践定，但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 5、种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。6、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度；质：形态、理化指标、pH、酶活、无污染7、种子异常分析：菌种生长速度，过快或过慢；菌丝结团；菌丝粘壁 8、影响种子质量的因素：原材料质量、培养温度、湿度、通气与搅拌、斜面冷藏时间、培养基、pH9、种子质量的控制措施：菌种稳定性的检查、提供适宜的生长环境、种子无杂菌检查，保证纯