刘升波博士毕业论文.doc

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1、山东大学博士学位论文分类号： Q93单位代码：10422密 级：学 号：200711436博 士 学 位 论 文论文题目：海冰细菌Pseudoalteromonas sp. SM20310和深海细菌Zunongwangia profunda SM-A87胞外多糖的研究Study on the Exopolysaccharides from Sea-ice Bacterium Pseudoalteromonas sp. SM20310 and Deep-sea Bacterium Zunongwangia produnda SM-A87作 者 姓 名 刘 升 波 专 业 微生物学 指导教师姓名

2、陈 秀 兰 专业技术职务 教 授 2012年4月15日原 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名： 日 期： 关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名： 导师签名： 日 期： 2山东大学博士学位论文目录摘 要IAbstractVI缩 写XII第一章 研究背景与立题依据11.1 研究背景11.1.1 细菌胞外多糖21.1.1.1 细菌多糖的分类21.1.1.2 细菌胞外多糖的组成与结构31.1.1.3 细菌胞外多糖的生理功能31.1.1.4 细菌胞外多糖的生物合成和组装41.1.1.5 细菌胞外多糖的生物合成的遗传调控71.1.1.6 细菌胞外多糖的物理性质81.1.1.7 细菌胞外多糖的发酵生产91.1.1.8 细菌胞外多糖的提取和纯化13

4、1.1.1.9 细菌胞外多糖的结构解析151.1.1.10 细菌胞外多糖的应用171.1.2 海洋极端环境细菌胞外多糖的研究进展191.1.2.1 海洋细菌胞外多糖的生物学功能191.1.2.2 海洋细菌胞外多糖的结构201.1.2.3 南北极环境的细菌胞外多糖201.1.2.4 深海环境的细菌胞外多糖221.2 立题依据与研究内容251.2.1 立题依据251.2.2 研究内容26第二章 海冰细菌中胞外多糖产生菌的筛选和鉴定282.1 引言282.2 试验材料、试剂与仪器282.2.1 菌株和质粒282.2.2 主要试剂292.2.2.1 主要试剂和试剂盒292.2.2.2 试剂的配制292

5、.2.3主要仪器设备302.2.4 培养基312.2.5 数据库及分析软件312.3 试验方法312.3.1 苯酚硫酸法总糖标准曲线的制作和样品中总糖含量测定312.3.2 高产胞外多糖菌株的筛选322.3.2.1 刚果红平板法322.3.2.2 富糖平板菌落筛选322.3.2.3 液体发酵培养基筛选332.3.3 菌株SM20310的初步鉴定332.3.3.1 生长特性研究332.3.3.2 16S rRNA基因序列的获得和系统发育学分析332.4 结果与分析352.4.1总糖标准曲线352.4.2 高产胞外多糖菌株的筛选352.4.3 菌株SM20310的初步鉴定372.4.3.1 生长特

6、性研究372.3.3.2 系统发育学分析382.5 讨论40第三章 海冰细菌SM20310胞外多糖的发酵、分离纯化和结构解析413.1 引言413.2 试验材料、试剂与仪器423.2.1 菌株423.2.2 主要试剂423.2.3 主要仪器设备433.2.4 培养基433.3 试验方法433.2.5 菌株SM20310胞外多糖的发酵条件优化433.3.1.1发酵液多糖含量的测定433.3.1.2 不同碳源对胞外多糖产量的影响443.3.1.3 不同温度对胞外多糖产量的影响443.3.1.4 不同盐度对胞外多糖产量的影响443.3.2 菌株SM20310胞外多糖的分离纯化443.3.2.1 菌株

7、SM20310胞外多糖的提取443.3.2.2 菌株SM20310胞外多糖的分离纯化453.3.2.3 纯化的胞外多糖的纯度检验453.3.3 菌株SM20310 胞外多糖的结构解析463.3.3.1 糖基组成分析463.3.3.2 糖苷键连接类型分析463.3.3.3 核磁共振图谱分析463.4 结果与分析473.4.1 菌株SM20310胞外多糖的发酵条件优化473.4.1.1 不同碳源对胞外多糖产量的影响473.4.1.2 不同温度对胞外多糖产量的影响483.4.1.3 不同盐度对胞外多糖产量的影响493.4.2 菌株SM20310胞外多糖的分离纯化503.4.2.1 DEAE-Seph

8、arose Fast Flow阴离子交换层析503.4.2.2 Sepharose 4B凝胶层析513.4.2.3 纯化的胞外多糖的纯度检验513.4.3 菌株SM20310胞外多糖的结构解析533.4.3.1 糖基组成分析533.4.3.2 糖苷键连接类型分析543.4.3.3 核磁共振分析553.5 讨论60第四章 海冰细菌SM20310胞外多糖的生态学作用624.1 引言624.2试验材料、试剂与仪器634.2.1 菌株和样品634.2.2 主要试剂634.2.3 主要仪器设备634.2.4 培养基634.3 试验方法634.3.1 菌株SM20310 胞外多糖对菌株高盐耐受性的影响63

9、4.3.2 菌株SM20310 胞外多糖的防冻保护作用644.3.1 1 胞外多糖对其自身的防冻保护作用644.3.1.2 胞外多糖对非南极细菌E. coli的防冻保护作用644.4 结果与分析654.4.1 菌株SM20310 胞外多糖对菌株高盐耐受性的影响654.4.2 菌株SM20310 胞外多糖的防冻保护作用674.5 讨论68第五章 深海沉积物细菌SM-A87胞外多糖的发酵条件优化715.1 前言715.2 实验材料、试剂和仪器735.2.1 菌株样品735.2.2 主要试剂745.2.3 主要仪器设备745.2.4 培养基745.3 试验方法745.3.1发酵液粘度和多糖含量测定7

10、45.3.2不同碳源对于胞外多糖产量的影响745.3.3 响应面法优化产胞外多糖发酵条件755.3.3.1 PB设计755.3.3.2 最陡爬坡试验775.3.3.3 中心组合设计785.3.3.4 统计学分析795.3.3.5 验证最优发酵条件795.3.4 降低发酵胞外多糖成本的研究795.3.4.1 用乳清代替乳糖发酵胞外多糖795.3.4.2 用豆粕代替蛋白胨和酵母粉发酵胞外多糖805.3.5 乳清与乳糖发酵的胞外多糖的流变学性质比较805.3.5.1 胞外多糖的提取805.3.5.2 胞外多糖的浓度对溶液粘度的影响805.3.5.3 剪切速率对不同浓度胞外多糖的粘度影响815.3.5

11、.3 温度对胞外多糖粘度的影响815.3.5.4 pH对胞外多糖的粘度的影响815.3.5.5 盐浓度对胞外多糖的粘度的影响815.4 结果与分析815.4.1不同碳源对于胞外多糖产量的影响815.4.2 响应面法优化产胞外多糖发酵条件825.4.2.1 PB设计825.4.2.2 最陡爬坡试验845.4.2.3 中心组合设计845.4.2.4 验证最优发酵条件895.4.3 降低发酵胞外多糖成本的研究905.4.3.1 不同乳清浓度对胞外多糖产量的影响905.4.3.2 用豆粕代替蛋白胨和酵母粉发酵胞外多糖915.4.4 乳清与乳糖发酵的胞外多糖的流变学性质比较925.4.4.1 胞外多糖的

12、浓度对溶液粘度的影响925.4.4.2 剪切速率对不同浓度胞外多糖的粘度影响935.4.4.3 温度对胞外多糖粘度的影响945.4.4.4 pH对胞外多糖的粘度的影响955.4.4.5 盐浓度对胞外多糖的粘度的影响955.5 讨论96第六章 深海沉积物细菌SM-A87胞外多糖的分离纯化和结构解析1006.1 引言1006.2 实验材料、试剂和仪器1016.2.1 菌株和样品1016.2.2 主要试剂1016.2.3 主要仪器设备1016.2.4 培养基1016.3 试验方法1016.3.1 菌株SM-A87胞外多糖的分离纯化1016.3.1.1 菌株SM-A87胞外多糖的提取1016.3.1.

13、1 菌株SM-A87胞外多糖的分离纯化1026.2.2 菌株SM-A87胞外多糖的结构解析1026.2.2.1 糖基组成分析1026.2.2.2 糖苷键连接类型分析1026.2.2.3 核磁共振图谱分析1026.4 结果与分析1036.4.1 菌株SM-A87胞外多糖的分离纯化1036.4.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析1036.4.1.2 Sepharose 4B凝胶层析1046.4.1.3 纯化的胞外多糖的纯度检验1046.4.2 菌株SM-A87胞外多糖的结构解析1066.4.2.1 糖基组成分析1066.4.2.2 糖苷键连接类型分析1076.4

14、.2.3 核磁共振分析1086.4 讨论114第七章 深海沉积物细菌SM-A87乳糖利用机制的初步探索1177.1 引言1177.2 实验材料、试剂和仪器1177.2.1 实验材料1177.2.2 主要试剂和试剂盒1177.2.3 主要仪器设备1187.2.4 培养基1187.2.5 数据库及分析软件1187.3 试验方法1187.3.1 菌株SM-A87乳糖转运机制分析1187.3.1 菌株SM-A87的培养和取样1197.3.2 菌株SM-A87总RNA的提取和反转录1207.3.3 RT qPCR1217.3.3.1 引物设计1217.3.3.2 PCR体系和程序1227.4 结果与分析

15、1237.4.1菌株SM-A87乳糖转运机制分析1237.4.2 -半乳糖苷酶的相对表达量1257.4.3 菌株SM-A87对乳糖分解代谢的途径分析1277.4 讨论129全文总结与展望1311 本论文取得的创新性结果1312 本论文存在的问题及展望132参考文献133在读期间发表的论文目录143致 谢144153海冰细菌Pseudoalteromonas sp. SM20310和深海细菌Zunongwangia profunda SM-A87胞外多糖的研究摘 要海洋覆盖了超过75%的地表面积，这就提供了一个巨大的发现新化合物及其新用途的潜在资源。海洋微生物种类繁多、分布广泛，在海冰和深海等极

16、端环境中都有大量微生物生存。海冰是地球上最主要的生境之一，海冰最大能覆盖35 106 km2即地球表面积的13%。海冰环境由于低温、高盐等特殊的生存环境，使得生存于其中的微生物能够产生具有特殊功能的次级代谢产物。此外，60%的海洋是深度超过2000 m的深海，深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温（深海热液口除外)、高压、黑暗、高盐、寡营养。深海中生活着多种极端微生物，比如嗜（耐）热菌、嗜（适）冷菌、嗜（耐）压菌、嗜（耐）盐菌等，它们是各种极端大分子化合物的产生菌，因此深海微生物也是分离纯化各种极端化合物的重要资源。胞外多糖是一类高分子的碳水化合物多聚物，据报道海洋中的微生物细胞表面大都包裹一

17、层胞外多糖。胞外多糖在帮助细菌适应低温、高盐以及寡营养的海洋环境中有重要的作用。研究海洋极端环境细菌分泌产生的胞外多糖，可能能够揭示其适应不断变化的海洋极端环境的适应机制。这将有助于阐明生物的起源以及适应与进化等生物学重大理论问题。同时，海洋极端环境微生物也是新的功能化合物和特殊功能基因的重要来源，具有潜在的应用前景和巨大开发价值。菌株Pseudoalteromonas sp. SM20310分离自北极海冰，海冰样品是2003年8月中国第二次北极科学考察期间搭乘中国破冰船雪龙号采自Canada Basin (7730N-8012N)。本论文解析了菌株SM20310分泌产生的胞外多糖的结构，随后

18、研究了胞外多糖在海冰环境中的生态学功能。菌株Zunongwangia profunda SM-A87是从南冲绳海槽1245 m深的海底沉积物中分离得到，经鉴定为新属，命名为Zunongwangia profunda SM-A87。经研究发现此株菌在胞外可以形成由多糖构成的很厚的荚膜。本论文以深海细菌SM-A87 为出发菌株，用响应面法研究了胞外多糖的最佳发酵条件，提高了其胞外多糖的产量，并初步解析了胞外多糖的结构，随后对菌株SM-A87利用乳糖的机制进行了初步探索。1. 海冰细菌中胞外多糖产生菌的筛选和鉴定本论文用刚果红平板法、富糖平板法和液体发酵培养三种筛选方法，对北极海冰来源的110株细菌

19、进行了筛选，筛选出了13株高产胞外多糖的细菌。这13株菌的胞外多糖的产量在50-567 mg/L之间，其中菌株SM20310是胞外多糖产量最高的一株菌。对菌株SM20310的16s rRNA基因序列进行了测定与分析，结果显示其基因序列与Pseudoalteromonas属的相似性达到99%，因此菌株SM20310属于假交替单胞菌属。用16s rRNA基因序列构建的进化树也表明了菌株SM20310属于Pseudoalteromonas属，并且与该属中的Pseudoalteromonas issachenkonii和Pseudoalteromonas tetraodonis最为相近，暂定名为Pse

20、udoalteromonas sp. SM20310。2. 海冰细菌SM20310胞外多糖的发酵、分离纯化和结构解析本论文研究了不同碳源、不同培养温度和不同盐度对菌株SM20310胞外多糖产量的影响。结果显示，碳源为葡萄糖时，菌株SM20310胞外多糖产量最高，由此确定葡萄糖作为产糖的最佳碳源。在7oC低温条件下，胞外多糖的产量高于其在15oC和35oC条件下的产量。在10、30、60和90不同的盐度下，胞外多糖产量有明显不同。在30盐度条件下，接近于菌体生长繁殖的最适盐度，胞外多糖产量最高。而在低盐10 NaCl条件下，产糖量提高较快但最终产量略低于30盐度条件。在高盐60和90 NaCl浓

21、度下菌株生长较慢，但在长时间培养后也能达到较高的胞外多糖产量，这说明菌株Pseudoalteromonas sp. SM20310的胞外多糖可能在高盐条件下有一定生态学功能，与海冰盐通道中高盐度环境相适应。随后，本论文用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sepharose 4B凝胶层析技术对菌株SM20310胞外多糖进行了分离纯化，经检测其纯度和均一度达到了色谱纯，符合进一步结构分析的要求。最后，本论文对胞外多糖的结构进行了解析，通过GC/MS分析了菌株SM20310胞外多糖的单糖组成种类，结果显示SM20310胞外多糖主要单糖组成是甘露糖（71.7%）、葡萄糖（

22、10.7%）以及少量的鼠李糖（2.1%）、木糖（0.9%）、半乳糖（9.0%）、N-乙酰半乳糖胺（1.5%）和N-乙酰葡萄糖胺（0.7%）。糖苷键连接方式分析表明，菌株SM20310胞外多糖中末端甘露糖残基，2或3-连接的甘露糖残基是最主要的组分。可以看出，此多糖为高度分支的甘露聚糖，并含有少量的其他单糖残基。1-D质子谱显示出几个异头物信号（H 5.29, 5.11, 在5.06 ppm和4.91 ppm处有重叠信号），在3.4和4.2 ppm之间有糖环的重叠峰。分析2-D NMR数据可知，主要的异头物信号来自于各种连接方式的-甘露糖残基。在4.52 ppm (d, J1,2=7.8Hz)

23、处的小的异头物信号可能来自于1,4-连接的-D-葡聚糖。多糖的骨架由1,2-，1,6-Man组成，并且有相当多的6-Man的2-位有单个的末端甘露糖或两个甘露糖残基的侧链:6)-Manp-(16)-Manp-(16)-Manp-(12)-Manp-(12)-Manp-(13. 海冰细菌SM20310胞外多糖的生态学作用培养基中加入胞外多糖能明显提高菌株SM20310耐盐性。在没有胞外多糖加入的培养基中，菌株SM20310只能在盐度小于110的培养基中生长。然而，在含有0.5 mg/L的胞外多糖的培养基中，菌株能在盐度120的培养基中生长；在含有1.0 mg/L的胞外多糖的培养基中，菌株能在盐度

24、130的培养基中生长。同时，在盐度70-120的培养基中，胞外多糖的加入能明显提高菌株SM20310的生长速度。经过3、5和7次冻融循环，随着胞外多糖的浓度从0增加到30 mg/L，菌株SM20310和Escherichia coli的存活细胞数量都有明显提高。其中，3次冻融循环后，在30 mg/L浓度的胞外多糖条件下的SM20310的存活细胞数量为2.65 106/mL，是不加胞外多糖阴性对照的7倍，同时，E. coli的存活细胞数量为1.83 106/mL，为阴性对照的18倍。此外在加入胞外多糖的情况下经过冻融循环后，菌株SM20310的存活率明显高于E. coli。以上结果说明了菌株SM

25、20310分泌的胞外多糖可能在北极海冰环境具有保护菌体不受反复冻融的伤害。4. 深海沉积物细菌SM-A87胞外多糖的发酵条件优化首先考察了5种不同碳源葡萄糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖对菌株SM-A87胞外多糖产量的影响，乳糖作碳源时，胞外多糖的产量比其余四种糖具有较明显优势，胞外多糖产量达到6.5 g/L。Plackett-Burman设计结果乳糖、蛋白胨浓度和培养温度是对发酵液粘度和胞外多糖产量有显著影响的因子。根据中心组合设计得到的数学模型，预测菌株SM-A87产糖最优的培养方案为：乳糖浓度32.22 g/L，蛋白胨浓度8.87 g/L，培养温度9.76oC。在此条件下菌株SM-A87胞

26、外多糖产量最高值达到8.90 g/L，发酵液粘度达到6551 mPas，相比于优化前的胞外多糖产量（6.47 g/L）和发酵液粘度（3575 mPas）有大幅提高。到目前为止，菌株SM-A87胞外多糖的产量是海洋来源的细菌中产量最高的。为降低菌株SM-A87胞外多糖的成产成本，用乳清、豆粕和NaCl代替发酵培养基中的乳糖、蛋白胨、酵母粉和海盐，发现在此条件下菌株SM-A87能保持较高的胞外多糖的产量（8.1 g/L）和发酵液粘度（9914 mPas）。对两种培养基发酵生产的多糖流变学性质研究表明，除了后一种培养基发酵产生的多糖粘度较高外，两种多糖的物理性质并无差异。5. 深海沉积物细菌SM-A

27、87胞外多糖的分离纯化和结构解析用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sepharose 4B凝胶层析技术对菌株SM-A87胞外多糖进行了分离纯化，经检测其纯度和均一度达到了色谱纯，符合进一步结构分析的要求。单糖组成分析显示，菌株SM-A87胞外多糖中含量最高的单糖残基是葡萄糖含量达到44.2%，其次是甘露糖残基含量达到27.7%，另外，还有14.2%的半乳糖残基10.1%的木糖残基，少量的岩藻糖残基（2.4%）和葡萄糖醛酸（1.3%）。糖苷键连接方式表明SM-A87胞外多糖中末端半乳糖残基，2-连接的甘露糖残基和4-连接的甘露糖残基是主要的连接方式，分别占20.5

28、、19.9和20.7%。此外还有11.5%的末端葡萄糖残基，10.3%的3-连接的木糖残基，9.9%的3,4-连接的葡萄糖残基，5.7%的末端岩藻糖残基等其他连接方式。对多糖进行了超声波处理和梯度酸水解后用HPLC分离水解下的各个组分，用NMR进行分析。最终得到菌株SM-A87胞外多糖的结构如下：3)-4Lacp-a-Glcp-(13)-b-Xylp-(14)-b-Manp-(12)-a-Glcp-(13)-a-GlcpA-(13)-a-Fucp-(16. 深海沉积物细菌SM-A87乳糖利用机制的初步探索在已有的菌株SM-A87基因组基础上，分析乳糖的利用转化途径，利用实时荧光定量PCR技术分

29、析了菌株在利用乳糖合成胞外多糖的过程中关键酶的表达情况，最终初步提出乳糖的转化途径：乳糖很可能是通过ABC-转运系统通过消耗ATP转运至胞内再被-半乳糖苷酶（GalC，ZPR_1388）分解成葡萄糖和半乳糖，然后在酶的作用下转变为合成胞外多糖的前体UDP-葡萄糖、GDP-甘露糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖、GDP-岩藻糖和UDP-葡萄糖醛酸。这些活化的单糖在糖基转移酶的作用下连接至多糖链上。关键词：海冰细菌、深海细菌、胞外多糖、多糖结构、生态学功能、响应面法Study on the Exopolysaccharides from Sea-ice Bacterium Pseudoalterom

30、onas sp. SM20310 and Deep-sea Bacterium Zunongwangia produnda SM-A87AbstractThe ocean covers more than 75% of the earths surface and this offers a great potential for the discovery of new natural resources and new applications of them. There are various and abundant microorganisms in the marine, eve

31、n in extreme marine environments such as sea ice and deep-sea. Sea ice is a special marine environment, which covers 35 106 km2 or 13% of the worlds surface area at its maximum. Due to low temperature, high salinity and other extreme living conditins, microorganisms living in the sea ice can produce

32、 secondary metabolites with special features. Meanwhile, 60% of the ocean is the deep-sea with depth more than 2,000 m, which harbors a variety of bacteria which are valuable resources for discovery of new drugs and enzymes. The deep-sea is an extreme environment and harbors a variety of extremophil

33、es adapted to darkness, high pressure, high salinity, low or high temperature and low nutrient. These extremophiles will have broad potential applications in industry, medicine and environment protection.Exopolysaccharides (EPSs) are high molecular weight carbohydrate polymers that make up a substan

34、tial component of the extracellular polymers surrounding most microbial cells in the marine environment. The EPSs may assist microbial communities to endure extremes of temperature, salinity, and nutrient availability in the marine environment. The study of the EPSs produced by these extremophiles,

35、may be able to reveal their adaptation mechanisms to adapt to changing ocean extreme environments. This will help to elucidate some significant theory of biology, such as the origin, adaptation and evolution of the life. Microorganism from these extreme marine environmental is also an important sour

36、ce of new functional compounds with great potential application.The strain SM20310 was isolated from the Arctic sea ice, Canada Basin (7730 N-8012 N), and was identified as a Pseudoalteromonas strain. The EPS produced by strain SM20310 was purified and its structure was characterized. Furthermore, t

37、he effect of the EPS on the high-salinity tolerance of strain SM20310 and its cryoprotective effect on this strain were studied. Zunongwangia profunda SM-A87 was isolated from the deep-sea sediment of the southern Okinawa Trough area at a water depth of 1245 m. In this study, Response surface method

38、ology was used to optimize the fermentation conditions for EPS production by strain SM-A87. The EPS produced by strain SM-A87 was also purified and its structure was characterized. In addition, the mechanism of strain SM-A87 using of the lactose was preliminarily investigated.1. Screening and identi

39、cation of strain SM20310Thirteen EPS-producing strains were screened from the 110 sea ice strains using Congo red agar plate method and liquid medium fermentation methods. The EPSs yields of these strains under our experimental conditions were in the range of 50-567 mg/L. Strain SM20310 with the hig

40、hest EPS production was selected for further analysis.Based on the amplified sequence of the nearly complete 16S rRNA gene of strain SM20310, the phylogenetic affiliation of this strain was analyzed. A phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of all known related species was constructe

41、d. Strain SM20310 is fell in a sub-branch of the genus Pseudoalteromonas in which many Antarctic strains are found. Strain SM20310 is therefore a member of genus Pseudoalteromonas of the class Gammaproteobacteria and clustered closely with Pseudoalteromonas issachenkonii and Pseudoalteromonas tetrao

42、donis.2. Extraction, purication and structural characterization of the EPS from strain SM20310The effect of four different carbon sources, different incubation temperature and different concentration of NaCl on the EPS production of strain SM20310 were studied. The maximum EPS production was detecte

43、d when glucose was served as carbon source, incubated at low temperature and NaCl concentration at 3%.After precipitation from the fermentation broth with absolute ethanol and deproteination using the Sevag method, the EPS was further purified by anion-exchange chromatography and gel-filtration chro

44、matography. Purity verification of the EPS was performed on a Shimadzu analytical HPLC system. Only one symmetrical acute peak was detected from the purified EPS sample on the Shimadzu analytical HPLC system, which indicated that this EPS sample consisted of a single homogeneous component and could

45、be used for structure analysis.Glycosyl composition analysis of the EPS was performed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) and the results showed that it is composed mainly of mannose, with glucose, galactose, rhamnose and minor peaks for mannose, N-acetyl galactosamine, N-acetyl glucosam

46、ine and xylose. Consistent with the glycosyl composition analysis, glycosyl linkage analysis of the EPS sample showed that it is composed mainly of terminally linked mannopyranose, 3 linked glucopyranose, 2,6 linked mannopyranose, 2,4,6 or 2,3,6 linked mannopyranose, 6 linked mannopyranose and minor peaks for other residues. The overall picture of the EPS was that of a highly branched mannan with low levels of other sugars present.Based on the glycosyl composition and glycosyl linkage analysis, the structure of the EPS was furth