《有机酸发酵》有机酸发酵工业进展课件.ppt

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1、有机酸发酵工业进展,报告内容,一.有机酸发酵工业概况二.中国有机酸发酵工业现状及成就三.中国有机酸发酵研究进展举例 丙酸发酵-酮戊二酸发酵四.中国有机酸发酵工业展望,一、有机酸发酵工业概况,有机酸概述,有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸,其酸性源于羧基(-COOH),Various substances that can be derived from succinic acid by chemical conversion.,Trends in Biotechnology,2008:100-108,有机酸概述,有机酸也是重要的平台化合物,Renewable raw ma

2、terials,全球有机酸的产量超过300万吨、产值超过50亿美元,柠檬酸,乳酸,苹果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,酒石酸,丙酸,C2,C3,C4,C5,C6,丙烯酸,富马酸,酒石酸,有机酸发酵概况,二、中国有机酸发酵工业现状及成就,中国有机酸发酵工业现状,有机酸工业是发酵工业领域一个成熟的分支。2012年中国有机酸的总产量超过200万吨。,柠檬酸,乳酸,苹果酸,葡萄糖酸,醋酸,衣康酸,曲酸,丙酮酸,食品和饮料,医药工业,化学工业,建筑业,例如:酸味剂,例如:抗凝血剂,例如:洗涤剂,例如:混泥土,日照鲁信金禾生化有限公司,安徽丰原集团,河南金丹乳酸科技股份有限公司,潍坊英轩实业有限

3、公司,山东柠檬生化有限公司,宜兴协联生物化学有限公司,杭州宝晶生物化工有限公司,青岛科海生物有限公司,天富生化技术有限责任公司,西王集团,主要生产企业,产品,应用领域,沈阳科纳提克公司,酒石酸,其他工业,例如:显影剂,琥珀酸,安徽雪郎生物科技股份有限公司,丙酸,中国有机酸发酵工业成就,(1)自主创新能力显著增强,研发投入加大:企业研发投入约占销售收入的3-5%。,研究平台,衣康酸:2000年获国家科技进步二等奖。,长链二元酸:2006年获国家科技进步二等奖。,丙酮酸:2006年获国家科技进步二等奖。,L-乳酸:2011年获国家科技进步二等奖。,“丙酮酸发酵技术”被世界上最大发酵公司之一日本味之

4、素公司购买,成为该公司从中国购买的第一个技术。,中国有机酸发酵工业成就,(2)产品产量迅速提高、产品结构更趋合理,近20年,我国有机酸发酵工业主要产品的总产量呈快速增长的态势。产品品种从早期2-3个发展到10余个。,近20年有机酸主要产品产量,单位:万吨,中国有机酸发酵工业成就,(3)生产技术水平不断上升（以柠檬酸为例）,有机酸行业龙头近年来纷纷通过扩大优势产品的产能,提高抗风险能力,使得行业产业集中度呈现逐步提高态势,规模经济效应也使行业平均期间费用率呈现下降的趋势,这有利于保障行业的盈利能力提升与长期发展。,中国有机酸发酵工业成就,(4)企业规模扩大,产业集中度增强,我国有机酸发酵行业产业

5、集中度,中国有机酸发酵工业成就,(5)新技术、新材料和新装备得到广泛应用,酶技术、膜技术和计算机技术越来越多的被采用,设备趋于大型化、连续化和自动化,三.中国有机酸发酵研究进展丙酸,丙酸的应用及市场,2012:260m lbs(117,936 tonnes),化学法:2万/吨,发酵法:6万/吨（食品安全）,丙酸钙价格,06年全球产量37.7万吨,75%用于谷物和饲料防腐,筛选丙酸高产菌,菌种鉴定,筛选野生型质粒,细胞壁裂解条件优化,条件:溶菌酶 20 mg/mL 37 oC,蛋白酶K 2 mg/mL 56 oC.“-”表示细胞壁没有裂解.“+”表示细胞壁被裂解.,质粒电泳图,质粒鉴定分析,质粒

6、ORF转录水平分析,丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析,丙酸杆菌代谢工程改造策略,过量表达甘油脱氢酶（gldA）,提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱氢酶（mdh）,富马酸水合酶（fumC）,提高丙酸代谢途径通量,gldA,mdh,fumC,过量表达甘油脱氢酶,野生菌与工程菌分批发酵对比:丙酸(PA),:甘油浓度,:细胞干重(DCW),:乙酸(AA),:琥珀酸(SA),:甘油脱氢酶比酶活.,培养基及培养条件优化,不同种类的碳源对丙酸发酵过程的影响,不同种类的氮源对丙酸发酵过程的影响,酵母粉浓度对发酵过程的影响,PA,DCW,PA,DCW,SA,最佳碳源为20 g/L甘油,最佳氮源为酵母粉,

7、最适浓度为10 g/L。最佳接种量为10%,最佳接种龄为48-60h左右种子,最佳培养温度为30。,MgSO4 7H2O(mg/L),DCW(g/L),SA(g/L),PA(g/L),金属Mg2+对发酵过程影响,金属Co2+对发酵过程影响,ZnSO4 7H2O(mg/L),金属Zn2+对发酵过程影响,金属Mn2+对发酵过程影响,培养基及培养条件优化-金属离子,最佳Co2+浓度为10 mg/L,发酵模式研究-分批发酵,分批发酵过程中,随着甘油浓度的增加,菌体比生长速率及丙酸的比合成速率显著下降,说明较高的甘油浓度不利于菌体生长及丙酸的合成。,发酵模式研究-分批发酵,不同甘油浓度下过程动力学参数比

8、较,随着初始甘油浓度的增加,发酵时间明显延长,生产强度显著下降;菌体干重先升高后降低;初始甘油浓度在20 g/L50 g/L时适合菌体生长。,仅通过分批发酵难以实现丙酸发酵高产量、高得率和高生产强度的统一,发酵模式研究-流加发酵,注:A 初始甘油浓度为20 g/L,48 h-96 h恒速流加浓度为400 g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01 L/h;B 初始甘油浓度为30 g/L,72 h-120 h恒速流加浓度为400 g/L的甘油水溶液,流速控制为0.01 L/h;C 初始甘油浓度为50 g/L,在96 h时一次性添加质量为80 g的纯甘油;D 初始甘油浓度为40 g/L,在84 h一次

9、性添加160g纯甘油;residual glycerol,PA,DCW,SA,*AA,不同流加发酵模式下过程动力学参数比较,发酵模式研究-流加发酵,最佳流加策略:初始甘油为30g/L,72-120h进行恒速流加,流加速率为0.11L/h(甘油浓度为400 g/L),发酵模式研究-10m3发酵罐放大试验,丙酸10 m3罐中试发酵过程曲线,residual glycerol,PA,DCW,SA,*AA,丙酸最高产量为47.28 g/L,生产强度为0.197 gL-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸,三.中国有机酸发酵研究进展-酮戊二酸,-酮戊二酸的应用,降低病患机体损耗,清除自由基,延缓衰老,提

10、高繁殖率,促进骨骼的生长,有机中间体,体格增强剂、运动饮料添加剂,医药,化妆品,食品,化工,饲料,-酮戊二酸市场概况,国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨,化学法,发酵法,筛选得到的菌种:解脂亚诺酵母,-酮戊二酸的生产方法,生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用,限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用,生产效率高环境友好食品安全性高,食品安全级生物法生产-酮戊二酸,土壤样品,维生素B1缺陷型筛选,500株微生物菌株,0.1 g/L 13.4%,0.1-1 g/L 74.4%,1-10 g/L 6.4%,10 g/L 5.8%,菌落形态,AGTCTAGTATAAACAATTAT

11、ACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGG

12、AAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG,18S rRNA,Yarrowia lipolytica WSH-Z06,生物法生产-酮戊二酸的关键问题,当以甘油为唯一碳源时,发酵6天后-KG产量可达30 g/L左右,但是发酵液中同时会积累大量的副产物丙酮酸(30 g/L左右)。,Y.lipolytica WSH-Z06摇瓶发酵曲线-KG(),Glycerol(

13、),Pyruvate(),DCW(),存在的问题,1.辅因子调控,3.节流,2.开源,4.调控转运蛋白,解决方案代谢工程改造解脂亚洛酵母,代谢工程改造解脂亚洛酵母,1.辅因子调控,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92 U/mg protein,过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51 U/mg protein,比对照分别提高了10.5和11.6倍,胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的231.2%和244.2%。,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1和ACL基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,:-KG;:Glycero

14、l;:pyruvate;:DCW,(A):The time-courses of fermentation in Y.lipolytica-CON;(B):The time-courses of fermentation in Y.lipolytica-ACS1;(C):The time-courses of fermentation in Y.lipolytica-ACL.,提高16.2%,提高28.6%,Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的产量分别为42.2 g/L和46.7 g/L,比对照菌(36.3 g/L)分别提高了16.2%和28.6%

15、。丙酮酸产量分别为14.5g/L和10.6 g/L,比对照菌(21.2 g/L)分别降低了31.6%和50%。,代谢工程改造解脂亚洛酵母,2.开源,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累,6.5倍,10.2倍,表达载体p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的构建,Y.lipolytica及其突变株胞内PC 酶活,转化子提取基因组进行PCR验证,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累,过量表达ScPYC1和RoPYC2基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,:-KG;:Glycerol;:Pyruvate;:DCW,(A):The time-courses of ferment

16、ation in Y.lipolytica-CON;(B):The time-courses of fermentation in Y.lipolytica-ScPYC1;(C):The time-courses of fermentation in Y.lipolytica-RoPYC2.,Y.lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的产量分别为45.2 g/L和49.1 g/L,比对照菌(36.3 g/L)分别提高了24.5%和35.3%。丙酮酸产量分别为10.2 g/L和6.4 g/L,比对照菌(21.2 g/L)分别降低了51.9%和69.

17、8%。,提高24.5%,提高35.3%,5 M3中试结果,Time course of fed-batch fermentation by constant feeding strategy in pilot scale,发酵156 h,PA:24.6 g/L;-KG:64.2 g/L,四.中国有机酸发酵技术展望,技术发展1:基于组学分析构建获得优良菌种,工业微生物基因组,组学分析,计算模拟,分子改造,新一代工业菌种,基因组,转录组,蛋白质组,代谢组,结构设计,途径设计,网络设计,数据集成,基因组理性设计,基因组网络重构,全局扰动优化,多位点快速进化,基因组删减优化,代谢途径优化,技术发展2:发展信息和控制技术提高装备水平,发酵过程的自动控制基于实时代谢流分析的在线状态预测与控制 基于智能控制系统的过程放大模拟系统 基于人工智能技术的过程控制与优化,细胞生理代谢与流场特性的结合生理代谢特征与代谢通量分析 基于传递、混合与生物反应动力学 计算流体力学、发酵罐流场的计算机模拟,技术发展3:技术集成提高产品质量和实现清洁生产,高效分离单元及装备的开发与集成连续板框过滤技术、膜过滤技术人工智能模拟与控制的结晶技术生化反应与分离耦合技术,资源和能量的高效利用 发酵过程清洁生产技术和闭路循环工艺发酵食品生产废渣资源化和高值化工艺发酵废弃物和副产物的综合利用和资源化处理,