基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目资金申请报告(已成功申请国家补助资金).doc

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1、第一章 项目的意义和必要性第一节 国内外现状和技术发展趋势一、国内外现状葡萄糖异构酶（Glucose Isomerase，简称GI），能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖转化为相应的酮糖，工业上主要用作果葡糖浆生产的催化剂。1967年，美国首次成功的进行了葡萄糖异构酶的工业化应用，至今国外的果葡糖浆生产业均已转向葡萄糖异构酶技术。由于葡萄糖异构酶结构稳定，是目前世界上公认的研究酶的催化机制、建立完整的蛋白质工程技术的最好模型之一，具有巨大的经济价值和理论研究意义，国外投入了大量的人力、物力对葡萄糖异构酶的酶学性质、固定化工艺、基因工程、晶体学及其蛋白质工程进行了系统的研究。如比利时的植物遗

2、传所、荷兰细菌遗传公司（Gist-brocades）、英国帝国理工学院生物工程中心、美国加州Cetus以及Amgen公司、加拿大及日本的一些研究机构等。国内自六十年代起已开展了葡萄糖异构酶应用于果葡糖浆生产的研究，山东省食品发酵工业研究设计院通过诱变筛选获得的7号淀粉酶链霉菌M1033菌株，是国内在这方面最具应用价值的工业菌株之一。目前国内外主要是通过诱变筛选等手段来获得生产用菌株，中国科学技术大学生命科学学院是国内唯一开展葡萄糖异构酶的蛋白质工程的研究单位。自国家“八六三”项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”立项以来，项目组的研究人员对葡萄糖异构酶的催化机理及其蛋白质工程进行了多年的研究和探索。

3、经十五年科技攻关，目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建高表达量的基因重组链霉菌工业生产菌株，获得了具有完整自主知识产权的同源重组基因工程菌株M1033WZ，其技术水平及工业应用价值在国内外处于领先水平。目前项目共获得3项国家发明专利：“SM33GI的突变酶GIG138P及一种提高GI热稳定性的突变方案”（专利号ZL95112782.9）、“一种葡萄糖异构酶的247位单突变体酶和138，247位双突变体酶及其构建方法”（专利号ZL97119714.8）、“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法

4、”(专利号：ZL02143031.4)，其中“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”已获得PCT国际专利受理。（见附件4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11）葡萄糖异构酶市场方面，目前我国还没有自己的葡萄糖异构酶生产企业，国内市场完全由丹麦诺维信公司所垄断，其产品均为进口分装，目前国内市场销售价约为38万元/吨。 二、我国酶制剂产业现状1965年，中国第一家酶制剂专业生产企业在无锡市成立，标志着中国酶制剂工业的起步，40年来，我国酶制剂产业从无到有，至今已具有一定规模。目前我国酶制剂生产企业约100家，但均为中小型企业，现有年生产能力约4

5、0多万吨，已实现工业化生产的酶种有20多种，主要集中在糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等三大类，大部分企业生产水平仅达到90年代末国际水平。我国酶制剂生产厂家主要产品大多停留在技术含量低、利润率低的产品上，如目前市场上5万单位糖化酶工厂成本约4400元/吨，售价仅为4600元/吨，2000单位中温淀粉酶工厂成本约7000元/吨，售价仅为8000元/吨，10万单位蛋白酶工厂成本约7200元/吨，售价仅为8100元/吨。同时许多工业生产急需的酶种如葡萄糖异构酶、普鲁蓝酶、真菌淀粉酶、乳酸酶、溶菌酶等又需大量从国外进口，这种情况既严重影响了我国酶制剂行业的健康发展，又增加了下游生产行业的生产成本。在当前的市场

6、情况下，安徽*生物技术有限公司紧抓机遇，依托中国科学技术大学的技术优势，生产科技含量高、技术壁垒高的基因重组葡萄糖异构酶，并将进一步发展多种高技术含量的酶种如普鲁兰酶、碱性蛋白酶、啤酒复合酶、真菌淀粉酶、乳酸酶、溶菌酶等，并争取以此带动国内的酶制剂生产企业赶上国外同行业水平。1991-1998年中国各类酶制剂的产量、总产量和销售情况 单位：千吨/百万元 表1-11991年1992年1993年1994年1995年1996年1997年1998年-淀粉酶11.6513.9820.0024.8830.8935.0032.0038.00糖化酶67.8274.2674.8093.44125.11160.0

7、0150.00138.00蛋白酶12.8314.9915.0227.4340.0245.0038.0040.00其它酶0.130.050.26-0.29-5.00总产量92.33100.33110.10145.92196.31240.00220.00221.00总销售额190.18225.95250.13328.93416.73521.60478.01480.00 2001年全国酶制剂行业重点生产企业表1-2北京市房山酶制剂总厂无锡杰能科生物工程有限公司黑龙江省肇东市酶制剂厂天津市利华酶制剂技术有限公司江苏江阴星达生物工程有限公司山东省沂水隆大生物工程有限责任公司河北邢台市翔宇生物工程有限公司

8、江西豪德集团生物工程实业有限公司湖南津市市新型发酵有限责任公司广东江门生物技术开发中心酶制剂厂宜兴杰成生物工程有限公司河南省三门峡发酵厂苏州宏达制酶有限公司张家港市金源生物化工有限公司烟台盛元鸿生物工程有限公司山东省安丘市酶制剂厂湖南省津市鸿鹰祥生物工程有限公司郑州市兴达发酵厂河北胜利酶制剂厂无锡市协达生物制品有限公司连云港元升实业股份有限公司赤峰红山生物工程有限公司 2000年酶制剂行业收入最大的十家主要企业表1-3公司名称（成立年份）主要产品无锡杰能科生物工程有限公司(1993)酶制剂宜兴杰成生物工程公司(1992) 淀粉酶河南省三门峡发酵厂(1980) 糖化酶安丘市酶制剂厂(1990)

9、糖化酶广州酶制品厂(1985) 木瓜酶江阴市星达生物工程有限公司(1995) 糖化酶河北省邢台市酶制剂厂(1953) 淀粉酶吉林省吉发集团农业开发股份有限公司糊精厂(1987) 麦芽糊精贵阳白云银星化工厂(1999) 触酶烟台盛元鸿生物工程有限公司(1999) 酶制剂三、技术发展趋势从天然菌株中分离纯化得到的野生型葡萄糖异构酶早已商业化，并取得了良好的经济和社会效益，但同时存在着一定的局限性。主要表现在葡萄糖异构酶在较高的反应温度下稳定性不够理想，在异构化反应中，温度越高(直至105110)，热力学平衡越趋向于果糖方向。因此，通过蛋白质工程改造葡萄糖异构酶的热稳定性，可以提高酶促反应速度，延长

10、酶寿命，降低生产用酶量，增加反应平衡过程中果糖的产量。目前各国科学家都在运用蛋白质工程技术改造葡萄糖异构酶，以寻求具有优越特性并适于工业化生产的葡萄糖异构酶及高表达菌株，使葡萄糖异构酶制剂工业从传统的依靠野生型菌株生产发展到运用基因工程菌株生产的阶段。而在这个领域，中国科学技术大学生命科学学院走在了前沿。国内外在葡萄糖异构酶的突变体构建方面存在多种突变方案，但真正通过蛋白质工程方法获得的有效突变，仅有比利时的Mrabet与法国、荷兰科学家合作构建的K253R，以及中国科学技术大学生命科学学院所构建的GIG138P和GIG138P-G247D等。中国科学技术大学生命科学学院所建立的葡萄糖异构酶蛋

11、白质工程研究系统在完整性和有效性上都达到国际先进水平，在7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶晶体结构模型的基础上，确立了突变体的分子设计，并发现PDB所提供的橄榄色链霉菌葡萄糖异构酶晶体结构是错误的模型。第二节 对产业发展的作用与影响葡萄糖异构酶是生产果葡糖浆的催化剂。人们利用淀粉为原料，经液化、糖化、异构化等作用，生产出的含葡萄糖和果糖的混合糖浆，国内称果葡糖浆，国外称高果糖浆，并分为42型、55型和90型。其中42型果葡糖浆含糖71、其中果糖占42，葡萄糖52，低聚糖6，甜度与蔗糖相当。果葡糖浆以其风味醇厚、食用后不会引起血糖升高、抑制体内蛋白质消耗等蔗糖不可比拟的优势，正在受到世人

12、的青睐。尤其是果葡糖浆在人体内的代谢不需经过胰岛素途径，故糖尿病人可以摄入果葡糖浆，这一突出优势更使近年来果葡糖浆的消费量年年攀升。2002年，美国果葡糖浆的消费量为1084万吨，而我国仅为120万吨，远远低于发达国家的水平。目前发展果葡糖浆已引起了国务院、轻工部的重视，计划到2010年发展到330万吨规模，届时对葡萄糖异构酶的需求量将达到800吨/年。果葡糖浆生产技术、尤其是酶制剂生产技术的落后是影响其发展的主要障碍。基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目的实施，对提高我国酶制剂产业化水平，推进国内食品行业的产品创新，提升食品生产技术水平，拉动农业产业化发展，节约稀有的土地资源，减少果葡糖浆生产

13、的资源消耗，节省外汇资源等具有广泛而深远的意义。具体体现如下：一、是进行农产品深加工、增加农产品高附加值、拉动农业产业化发展的需要长期以来由于产品深加工技术落后，我国的许多农产品加工一直处于产品加工链的初端，获得的收益与高端加工相比有巨大的悬殊。利用本项目产品可以进行玉米等农产品的深加工，生产附加值相对较高、经济效益显著、人民生活需要的果葡糖浆，实现农业的产业化发展。我国是淀粉生产的原材料大国，原料如玉米、薯干、马铃薯等资源丰富，以玉米为例，年产量已达1.2亿吨，居世界第二位，玉米的增产为发展果葡糖浆提供了物质基础。从市场看，进入2000年以来，果葡糖浆发展形势看好，产量攀升很快。果葡糖浆行业

14、的快速发展，可以解决农民增产不增收的制约瓶颈。一方面，由于玉米产区连年增产，市场供大于求，粮价下跌，为保证农民收入国家给予大量经济补贴；另一方面，蔗糖生产企业处于严重亏损的境地，生产成本比市场售价平均每吨高2000元左右，国家为稳定农民收入、维持甘蔗的收购价，也给予蔗糖生产企业大量补贴。这样我国资源丰富的淀粉类农产品深加工很不够，农民的收入无法提高，而国家在玉米、蔗糖等农产品上都要给予许多补贴。为了从根本上改变这种局面，我国已开始大力发展葡萄糖异构酶进行果葡糖浆的生产，以满足食品、饮料加工企业的需要，加大农产品深加工力度的同时，有效的减轻国家财政负担。从美国的情况来看，2002年深加工消耗玉米

15、4978.4万吨，果葡糖浆消耗玉米1955.8万t，占39.28%，发酵酒精占深加工玉米总量的38%，这两个产品就占深加工玉米总量的77.28%，是美国玉米深加工的主导产品，而果葡糖浆消耗的玉米量占第一位。我国2002玉米深加工仅消耗1000万吨，还不到玉米总产量的10%，其中果葡糖浆消耗玉米108万吨，占玉米深加工消耗的10%。本项目产品基因重组葡萄糖异构酶是生产果葡糖浆所必需的酶制剂，项目的建设是进行农业产业化，实现我国全面建设小康社会的需要。二、节约稀有的土地资源用淀粉生产果葡糖浆可以节省经济作物甘蔗用地，改种经济效益更好的农作物，利于土地资源的有效利用。生产1吨果葡糖浆用玉米1.7吨或

16、山芋干1.9吨，分别需耕地4亩或2亩；而以甘蔗生产1吨蔗糖需耕地10亩。若年产200万吨果葡糖浆，以玉米计可节约耕地1200万亩，以山芋干计可节约1600万亩，这对耕地面积日趋减少的我国来说，其意义更不可忽视。三、提高果葡糖浆生产厂家的能源和资源利用率，促进其环保效益 本项目产品投入使用后，由于提高了酶促反应温度，使反应速度加快，增加反应平衡过程中果糖的产量，同时减少了副产物的生成，可以简化果葡糖浆生产的后处理工艺，减少工业生产过程中废物的产生和排放，提高能源和资源利用率。另外葡萄糖异构酶可以重复使用，由于酶寿命的延长，降低了葡萄糖异构酶的使用量，从而可以节约国家资源，提高果葡糖浆生产的环保效

17、益。四、为国家节省外汇资源目前我国已建成投产的果葡糖浆生产规模超过100万吨，年消耗葡萄糖异构酶约300吨。目前国内市场上销售的同类产品全部由丹麦诺维信公司所垄断，其销售价约为38万元/吨，即每年需占用国家1亿元外汇资源。本项目建成投产后，完全可以满足国内市场需求量，每年可为国家节省1亿元外汇资源。五、是促进我国食品工业发展的需要糖是我国食品工业的重要原料，在糖类中，果葡糖浆具有蔗糖不可比拟的优势：味甜、成本低、风味醇厚、食用后不会引起血糖升高、抑制体内蛋白质消耗等优点。目前“果葡糖浆热”已在全世界掀起。近几年，世界上风行的运动饮料多以果葡糖浆为主要配方，许多国家正以果葡糖浆取代蔗糖。在我国，

18、2002年果葡糖浆的实际产销量仅为120万吨，远远低于发达国家（美国2002年果葡糖浆产量为1084万吨）的水平。除了消费意识落后、消费习惯、价格高、固定资产投资大、产业的生产惯性等原因外，果葡糖浆生产技术、尤其是酶制剂生产技术的落后是影响我国果葡糖浆产业发展的主要障碍。优势明显、风味独特的果葡糖浆将大力推进我国食品行业的产品创新，引领人民的生活质量向更高的水平发展。赶超世界果葡糖浆生产和应用水平是食品工业生产的重要任务之一，也是提升我国食品生产技术水平和发展工业经济的重要举措之一。六、是提高群众收入和保持社会繁荣稳定的需要本项目建成后可直接为社会提供150个就业机会，工人进厂月工资及附加达到

19、1000元以上，可大幅度提高当地群众收入水平，带动当地群众致富，推进区域经济的协调发展，有利于维护地区稳定、社会进步和经济繁荣。 第三节 产业关联度分析安徽*生物技术有限公司“基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目”实施的影响面大，与相关产业关系紧密，不可分割。项目建成后不但自身的经济效益显著，并且会带动相关行业迅速发展，获得较好的社会效益，促进经济发展。按产业关联度的基准定义内容，即前向关联、后向关联和旁侧关联分别分析如下：一、牵动上游相关行业发展（前向关联）：“基因重组葡萄糖异构酶工程产业化项目”形成规模后，涉及到所需的原辅材料及包装材料（如各类农副产品、包装材料及其他相关辅料等）全部在国内采

20、购，所需数量相当可观，牵动相关原辅材料及包装材料产业的发展壮大，并给这些行业增加经济效益，为国民经济增加了新的增长点；二、带动下游产业发展（后向关联）：生产本项目产品的发酵过程中产生的谷物糟渣可作为上佳的畜禽养殖饲料，对推动当地畜禽养殖业的发展和提高农民经济收入具有很大的促进作用；三、旁侧关联：生产基因重组葡萄糖异构酶的原料主要是各类农副产品，其下游相关联产品果葡糖浆的生产更需要消耗大量的农副产品。农副产品的特点是量大、笨重，需要较多的运力，因此该项目的建设能够带动运输业及其他服务业的发展。图1-1：产业关联分析图第四节 市场分析葡萄糖异构酶主要用于果葡糖浆的生产，依照目前的技术水平，1公斤葡

21、萄糖异构酶可生产约4吨果葡糖浆。由于目前国内对葡萄糖异构酶市场没有完备准确的调研报告可以参考，因此我们以果葡糖浆的市场情况来分析葡萄糖异构酶的市场情况。一、我国果葡糖浆发展情况虽然我国果葡糖浆研究工作起步较早，早在上世纪60中期几乎与日本和美国等发达国家同步开始，但由于条件不成熟，只有1976年安徽蚌埠果糖厂年产1600吨果葡糖浆的生产线效果较好。该厂生产的饮料“黄山可乐”也由于用果葡糖浆替代蔗糖做甜味剂，在市场上占有一席之地。1981年该厂又引进美国道尔公司年产万吨果葡糖浆的生产线，到1984年建成投产。国内还有一些小规模生产厂，如北京通县燕京果糖厂，北京房山果糖厂、河北南和县果糖厂等，主要

22、是供应周围地区食品生产厂家使用，由于发展缓慢，远远不能满足当前国内市场日益增加的需求。 近年来，随着科技的进步，人们对果葡糖浆的优越性的认识正在提高，特别是糖尿病作为一种常见疾病正严重危害广大群众的身体健康，食用果葡糖浆不会增加胰岛素负担这一优点正逐渐被大众接受，果葡糖浆的应用范围也更加广阔，市场容量连年增大。为适应这种需要，仅2000年以来，国内就建成山东保龄宝生物技术公司、河北邢台平安糖业公司等多家十万吨级果葡糖浆生产线。这些生产厂的新建和投产，为推动我国食品和饮料生产甜味剂的发展，与国际食品生产同步奠定了基础，为我国果葡糖浆生产赶超国际水平迈出了坚实的一步。二、果葡糖浆生产和消费的发展特

23、点1、发展迅猛。自从1975年以来，世界果葡糖浆的产量猛增了十八倍，从1975年的70万吨，到2000年已增加到1334万吨，25年间的年递增率达12.5。2、美国果葡糖浆产量占世界总产量的70左右。1980年美国的年产量约250万吨，2002年达1084万吨，净增834万吨。3、美国果葡糖浆的消费量最多，占世界消费总量的64。亚洲除日本和韩国以外，其他国家和地区的消费较少。在果葡糖浆的消费中又以果糖浓度55的第二代果葡糖浆最高，与第一代的42型之间的消费比约为3:2。4、我国果葡糖浆科研生产和消费的情况可以概括为几句话：起步早、发展缓慢、产量相对小。2002年实际产量近120万吨，与世界先进

24、国家比，差距甚大，需加快发展的步伐。世界范围内果葡糖浆迅猛发展的事实与我国发展缓慢、产量小之间的差距，揭示了我国果葡糖浆巨大的发展空间。三、制约我国果葡糖浆发展的原因1、传统生产企业生产成本高造成果葡糖浆销售价格高，价格因素是我国果葡糖浆生产和应用不能迅速发展的重要原因之一。由于受原料价格较高、技术与管理水平落后、项目投入资金量大等多种因素的制约，果葡糖浆价格一直居高不下，长期徘徊在每吨4000多元，产品缺乏市场竞争力，严重制约了果葡糖浆工业的发展。果葡糖浆与蔗糖成本比较单位：元/吨 表14果葡糖浆价格蔗糖价格蔗糖成本美国3700国内垄断，高于果葡糖浆价格5550日本27272200左右168

25、0中国42002200左右40002、对于食品厂而言，用果葡糖浆代替蔗糖还存在一些技术改造上的困难，如现有工艺配方需适当改变；原材料库存设备和运输工具也要投资改造；还有技术人员和操作工人尚需熟悉和摸索新材料的特性及利用方法等。我国加入WTO以来，随着国际市场的竞争加剧，国内玉米价格持续走低。其原因一是美国低价优质玉米大量涌入我国，2002年为585万吨，关税只有1%；二是玉米出口由于取消每吨44美元的国家标贴，出口受阻；三是库存暴满，供大于求，这些对果葡糖浆行业的发展是非常有利的。近年来果葡糖浆技术水平提高，企业生产规模扩大，基建投资大幅下降，加上原料玉米价格的下降，使果葡糖浆与蔗糖的比价有了

26、优势。玉米价1000元/吨左右，淀粉成本约1500元/吨，果葡糖浆生产成本仅为3000元/吨，当前正是果葡糖浆、葡萄糖异构酶等行业发展的有利时机。 四、葡萄糖异构酶的国内外情况目前国内近二十家酶制剂企业产品中均无固相化葡萄糖异构酶，国内所使用的葡萄糖异构酶全部为丹麦诺维信公司进口产品。根据中国轻工协会酶制剂分会提供资料，我国2000-2003年上半年果葡糖浆产量平均以10%增长，预计到2005年果葡糖浆产量为160万吨，葡萄糖异构酶需求量将达到400吨。近年果葡糖浆、葡萄糖异构酶销售量、需求量及未来年度预测单位：万吨 表152000年2001年2002年2003年2005年预计2010年计划果

27、葡糖浆90100120130160330葡萄糖异构酶220250300320400800丹麦诺维信公司在中国投资成立的诺维信（中国）投资有限公司是中国生物技术领域较大的外商投资公司。诺维信（中国）投资有限公司目前在中国拥有诺维信(中国)生物技术有限公司和诺维信(沈阳)生物加工有限公司两家全资生产子公司及一家合资公司。该公司的酶制剂产品广泛应用于淀粉、果蔬汁、啤酒、酒精、功能食品等行业，其产品在中国工业酶制剂市场占有较大的份额。丹麦诺维信公司酶制剂产品售价昂贵，一定程度上侵害了中国发酵生产企业的利益，其葡萄糖异构酶目前垄断国内及亚洲周边市场，其销售价约为38万元/吨。安徽*生物技术有限公司“基因

28、重组葡萄糖异构酶”产品的市场优势主要体现在以下几个方面：1、基因重组葡萄糖异构酶的热稳定性高于目前市场上的同类产品，降低了果葡糖浆生产厂家的生产成本；2、拥有中国科学技术大学及国家“八六三”项目的双重品牌优势；3、产品具备高科技含量，拥有完整的自主知识产权；4、利用阜阳廉价的原材料及劳动力，产品具备价格优势。五、市场预测果葡糖浆的诸多优点使其应用前景十分广阔，尤其是饮料、糕点等食品工业的理想用糖。国际市场方面，果葡糖浆在西方国家已被广泛使用，可口可乐、百事可乐等跨国饮料公司在国外大都使用果葡糖浆替代蔗糖作为甜味剂。目前，美国果葡糖浆的消费量已超过蔗糖的消费量，2002年果葡糖浆消耗量为1084

29、万吨，而同年蔗糖消耗量仅为690万吨；在西欧发达国家，果葡糖浆使用量已超过蔗糖使用量的50%；在亚洲，日本、台湾和韩国果葡糖浆的生产和消费也在以较快的速度增加。据美国Miles公司统计，全世界果葡糖浆产量和葡萄糖异构酶的销售额逐年上升，2002年葡萄糖异构酶的销售量约为3000吨，销售额达到1亿5千万美元。我国食糖不足，每年要花数亿美元进口。尽管这样，人均食糖仅8公斤，不及发达国家的1/8，仅为世界人均食糖1/4左右（见表1-3）。在糖类中，果葡糖浆具有蔗糖不可比拟的优势：味甜、成本低、风味醇厚、食用后不会引起血糖升高、抑制体内蛋白质消耗、低热量、易吸收、好消化等优点。目前我国制糖业的落后严重

30、影响着食品工业的发展，赶超世界果葡糖浆生产和应用水平是食品工业生产的重要任务之一，也是提升我国食品生产技术水平和发展工业经济的重要举措之一。因此发展果葡糖浆生产已引起了国务院及轻工部的重视，计划到2010年我国将要达到年产果葡糖浆330万吨规模，这将为葡萄糖异构酶的市场提供广阔的发展前景。2002韩、日、美、中淀粉糖消费情况表16国家淀粉糖果葡糖浆蔗糖产量万吨人均消耗KG/人产量万吨人均消耗KG/人人均消耗KG/人韩国9019481018日本22618110924美国14185110843920中国1601.41201.16.5果葡糖浆广泛应用于饮料、糕点、罐头、乳品等食品行业，其中饮料行业占

31、有相当大的比例，如美国达到70%。我国饮料工业起步较晚，但近年来发展十分迅速，销售额达400多亿，全国饮料总产量保持持续增长，1980年不足30万吨，1990年猛增到330万吨，到2000年为1491万吨，20年增长50多倍，平均年增长速度为21.8%，进入2001年达到1669万吨，比2000增长11.94%，继续保持两位数的增长速度，是食品工业发展最快的行业之一。依照国际惯例，称之为果汁型饮料的饮品，其果糖含量必须在11.7%以上，目前国内以“农夫果园”、“健力宝”为代表的大型饮料生产企业，均开始在饮料中添加果葡糖浆。近几年国内饮料实际产量及预测表1780年90年2000年2001年200

32、2年2003年2005年预计软饮料产量3033014911669242527883688其中:含糖饮料1000121513971847由以上数据及分析可以看出，由于国内果葡糖浆市场的迅猛成长，带动葡萄糖异构酶的销量年年攀升，目前国内葡萄糖异构酶的年消耗量约在300吨左右，并以每年10%的速度递增，预计到本项目建成投产时，市场年需求量将超过400吨。六、市场开发情况目前安徽*生物技术有限公司已与蚌埠明星果糖有限责任公司（原蚌埠果糖厂）、安徽丰原集团有限公司等企业进行了良好的沟通及合作，并初步达成基因重组葡萄糖异构酶的购买及使用意向（附件4-5）。 同时，世界上最大的果葡糖浆生产厂家美国嘉吉（Ga

33、rgill）公司也对*公司的基因重组葡萄糖异构酶产品产生浓厚的兴趣，近期正与*公司接洽，希望成为其合作伙伴及该产品在美国的销售总代理。 七、结论由以上分析可见，基因重组葡萄糖异构酶项目具有十分广阔的市场前景。本项目建成投产后，可年产葡萄糖异构酶300吨，基本可满足国内市场的需求量，待产品市场逐步打开后，完全有能力覆盖亚洲周边市场并出口欧美市场。第二章 项目的技术基础固定化葡萄糖异构酶是生产果葡糖浆的生物催化剂。葡萄糖异构酶（GI）又称木糖异构酶（XyI）（EC 5.3.1.5），能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖转化为相应的酮糖。因葡萄糖异构酶结构稳定，是国际上公认的研究酶的催化机制及建

34、立蛋白质工程技术的最好模型之一。工业上，葡萄糖异构酶是大规模从淀粉制备果葡糖浆的关键酶。随着我国食品工业的迅速发展，果葡糖浆在国内的市场增长迅猛，对葡萄糖异构酶的需求也在不断增加。由于其重要的经济价值和理论研究意义，美国、日本、英国、法国、比利时、荷兰等发达国家对该酶的性质、固定化工艺、基因工程、晶体学以及蛋白质工程等进行了广泛深入的研究。本项目主要技术原理为：利用基因工程技术改造已获得的7号淀粉酶链霉菌M1033的葡萄糖异构酶结构基因，通过基因突变的方法改变葡萄糖异构酶的热稳定性，采取基因敲除和基因置换的方法对7号淀粉酶链霉菌M1033的染色体进行改造引入优势突变位点，获得性能改良、稳定遗传

35、的适于工业化生产的基因工程菌株，从而应用于葡萄糖异构酶的大规模生产。国内自六十年代起已开展了葡萄糖异构酶应用于果葡糖浆生产的研究，山东省食品发酵工业研究设计院通过诱变筛选获得的7号淀粉酶链霉菌M1033菌株，是国内在这方面最具应用价值的工业菌之一。目前国内外主要是通过诱变筛选等手段来获得生产用菌株，中国科学技术大学生命科学学院是国内唯一开展葡萄糖异构酶的蛋白质工程的研究单位，并对葡萄糖异构酶的催化机理及其蛋白质工程进行了多年的研究和探索。经十余年科技攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建表达量极高的基因重组链霉菌工业生产菌株，获得

36、了具有完整自主知识产权的同源重组基因工程菌M1033WZ。所建立的葡萄糖异构酶蛋白质工程研究系统在完整性和有效性上都达到国际先进水平，在国内处于领先水平。在该课题的研究过程中，项目组在国内外知名刊物发表学术论文十余篇（附件4-15，4-16），并获得安徽省高等学校科学技术进步奖及安徽省优秀论文奖（附件4-17）。第一节 成果来源及知识产权情况中国科学技术大学生命科学学院独立承担国家“八六三”项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”（附件4-14），历经十余年联合科技攻关目，前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建高表达量的基因重组链霉菌工业生产菌

37、株，获得了具有自主知识产权的同源重组基因工程菌M1033WZ。中国科学技术大学根据学校知识产权管理规定，经慎重研究，决定将基因重组葡萄糖异构酶技术所有权作价175万元人民币作为学校投资投入中国科学技术大学科技实业总公司。（见附件4-11）2003年2月28日，中国科学技术大学科技实业总公司以合资成立安徽*生物技术有限公司补充协议的形式，将基因重组葡萄糖异构酶技术以177万元人民币的价格向合资公司转让，其中50万元按国家及学校有关政策奖励给相关技术团队成员。转让后，基因重组葡萄糖异构酶技术的所有权归安徽*生物技术有限公司所有。（见附件4-12、附件4-13）第二节 已完成研究开发工作及鉴定、中试

38、情况一、背景资料葡萄糖异构酶（Glucose Isomerase，简称GI）结构稳定，是国际上公认的研究酶的催化机制及建立蛋白质工程技术的最好模型之一。利用基因工程和蛋白质工程的方法改造野生型葡萄糖异构酶不仅具有理论研究意义而且具有重要的经济价值，在异构化反应中，温度提高，热力学平衡趋向于果糖方面，因此提高野生型葡萄糖异构酶的热稳定性可以增加反应平衡过程中果糖的产量，从而降低投入酶量，简化工艺流程，提高经济效益。基因的同源重组技术（homologous recombination），又称基因打靶（gene targeting），指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组并整合在

39、预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法。根据重组后靶基因的特征可以分为两种类型：1、由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有结构被破坏，此即为基因破坏或剔除（gene disruption or knockout）；2、靶基因的全部序列为新的基因所取代，即基因置换（gene replacement）。这一新兴技术已被证明为目前能精确的修饰基因组的最有效方法，从理论上讲它将使人类能按设计对极其复杂的细胞基因组结构进行定点、定量的改变，从而定向的改变细胞的遗传结构和特征。本项目在国内首次将基因重组技术应用于葡萄糖异构酶的研究和生产，其技术特性及所建立的葡萄糖异构酶蛋白质工程研究系统均达到国际先进水

40、平，所获得的基因重组葡萄糖异构酶适用于果葡糖浆的大规模生产，将从根本上改变我国葡萄糖异构酶生产的落后状态。二、成果的专利情况目前项目共获得3项国家发明专利：“SM33GI的突变酶GIG138P及一种提高GI热稳定性的突变方案”（专利号ZL95112782.9）、“一种葡萄糖异构酶的247位单突变体酶和138，247位双突变体酶及其构建方法”（专利号ZL97119714.8）、“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”(专利号：ZL02143031.4)，其中“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”已获得PCT

41、国际专利受理。（见附件4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11）三、成果鉴定及中试情况该项技术在2003年3月安徽省科技厅组织召开专项科学技术成果鉴定会上通过专家评审，认为“该课题采用的技术方法先进，技术路线正确，研究成果达到国内领先水平。建议尽快实现产业化。”，同时获得安徽省科技厅颁发的科学技术成果鉴定证书（2003年第030号）以及高新技术成果认定证书（2003-001号）。（见附件4-2、4-3）2002年10月28日至12月28日，中国科学技术大学生命科学学院委托蚌埠明星果糖有限责任公司（原蚌埠果糖厂）进行固定化葡萄糖异构酶大柱转化实验。经实验，在68转化温度及pH值7.5条

42、件下，单柱一次投入成品固定化葡萄糖异构酶93公斤（含水15.7%），经过60天转化共计生产出成品果葡糖浆408.3吨，平均转化能力为4.39吨成品果葡糖浆/公斤酶，转化率为52%。产品的各项性能指标在国内属先进水平，可以用于果葡糖浆的大规模生产。（见附件4-4）四、产品技术指标及与国内外同类产品比较1、产品技术、质量指标本项目产品将在满足中华人民共和国国家标准食品添加剂-固定化葡萄糖异构酶制剂（GB 8274-87）的基础上，全面提高葡萄糖异构酶各项性能指标，并逐步形成企业标准。产品的主要性能指标序号项 目理化指标1酶活力（60目）6000单位2形状不规则杆状，直径1.2mm3色泽棕色4含水1

43、2-18%5比重0.45kg/l6膨胀率2.5倍7转化能力4.2-4.5吨成品糖浆/公斤成品酶8保存性0-5下保藏3个月，酶活损失10%左右9最适pH7.510热稳定性最适反应温度6811金属离子影响Cu2+、Fe2+、Ca2+对酶活力发挥不力；Mg2+、Co2+可促进转化2、与国内、外同类产品技术指标比较本项目产品系国内首创，填补国内空白，国内目前无同类产品。现将该成果技术参数与丹麦诺维信公司的同类产品SweetzymeIT进行比较如下：序号指标名称单位SweetzymeIT基因重组葡萄糖异构酶1活力UGI350060002热稳定性55-60最适反应温度683PH7.6-7.87.54转化能

44、力吨成品糖浆/公斤酶54.2-4.5第三节 成果的创新之处本项目是国家“863”计划项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”的重要成果之一，解决了提高葡萄糖异构酶的热稳定性和酶活力的难题，并为基因重组葡萄糖异构酶的产业化生产打下坚实基础，拥有多项我国自主的知识产权，创新性强，技术水平高，难度大，许多成果在国际上居于领先地位。根据查新报告（见附件4-1），本项目的主要创新点和技术难点如下：1、双突变体酶GI（G138P-G247D）的构建技术双突变体酶的构建，使困扰葡萄糖异构酶研究和生产领域多年的野生型菌株所产的葡萄糖异构酶热稳定性和酶活力难以充分满足需要的难题得以解决，为利用基因工程技术改造葡萄糖异构

45、酶创造了条件。这一成就在国际上处于领先地位，并已申报国家发明专利。2、利用基因敲除和置换精确修饰链霉菌染色体技术本项目利用同源重组技术，把带有筛选基因的质粒片断的碱变性形式作为同源重组单元引入野生型M1033染色体DNA的特定片段上，敲除了原有的GI基因。再通过双抗性负筛选的方法，引入目的基因，并随染色体DNA的复制而稳定复制。3、双抗性负筛选（tsr + neo）方法的运用首先构建带有neo抗性的置换型同源重组质粒，通过neo抗性的负筛选来解决链霉菌基因置换时筛选工作量大的问题。由于同源片断较小，同时又为了保证较高的转化率，直接将同源重组质粒的碱变性形式作为同源重组单元转化缺陷型M1033原

46、生质体，获得插入型同源重组的GI酶活恢复菌株，再以该菌株为出发菌株，利用插入型同源重组质粒在染色体上的不稳定性，通过结合tsr抗性的负筛选最终获得基因置换菌株。此新方法在链霉菌染色体研究领域中尚未见报导。4、构建具有自主知识产权的基因工程菌株M1033WZ经过十余年的努力构建出的具有完整自主知识产权的基因工程菌株M1033WZ，现已被中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，是我国利用蛋白质工程改造葡萄糖异构酶重要成果之一，标志着我国在这个领域的研究已经跨入世界先进行列。“表达M1033GI的突变酶GIG138P的基因工程菌株M1033WZ及其构建方法”已经申请国家发明专利，并已获得PCT国际专利受理。5、双突变体的链霉菌基因工程菌株M1033XT的构建运用同源重组单交换和双抗性负筛选技术，构建出具有双突变点的GI（G138P-G247D）基因的7号链霉菌基因工程菌株M1033XT，使M1033XT所产的葡萄糖异构酶的各项主要性能均优于野生型M1033所产的葡萄糖异构酶，为