低聚木糖的模拟移动床色谱分离研究.doc

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1、低聚木糖的模拟移动床色谱分离研究孟 娜1，冯兴元2，王成福3，路福平1，*（1.天津科技大学生物工程实验室 ，工业微生物省部共建教育部重点实验室 ，天津 300457；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心 ，黑龙江大庆 163319；3.山东福田药业有限公司 ，山东禹城 251200）摘 要：研 究 了 用 模 拟 移 动 床 色 谱 分 离 高 含 量 低 聚 木 糖 的 工 艺 。 首 先 通 过 单 柱 固 定 床 实 验 来 选 择 适 合 低 聚 木 糖 分 离的 固 定 相 ， 比 较 了 不 同 类 型 的 离 子 交 换 树 脂 对 低 聚 木 糖 和 单 糖 混 合 液 的

2、 分 离 度 和 分 离 效 率 ，筛 选 出 DIAION-UBK530Na树 脂 为 合 适 的 分 离 介 质 ；然 后 运 用 真 实 移 动 床 模 型 ，近 似 确 立 模 拟 移 动 床 色 谱 分 离 工 艺 的 初 始 操 作 参 数 ，在 理 论 分 离 原 理 的 指 导 下 ，优 化 分 离 条 件 ，在 阀 切 换 时 间 为 300s、进 料 流 量 和 洗 脱 流 量 分 别 为 3.5mL/min和 5mL/min、提 取 液 和 提 余 液 流 量 分 别 为 3.8mL/min和 4.7mL/min、同 时 循 环 流 量 控 制 在 8.9mL/min的

3、条 件 下 ，使 分 离 后 的 低 聚 木 糖 、单 糖 纯 度 均 在90%以 上 ，收 率 分 别 达 到91.55%和92.18%。关键词：模 拟 移 动 床 色 谱 ，低 聚 木 糖 ，树 脂 ，优 化Study on separation of xylooligosaccharides by simulated movingbed chromatographyMENG Na1, FENG Xing-yuan2, WANG Cheng-fu3, LU Fu-ping1, *（1.Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry o

4、f Education，College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China；2.The Agricultural Products Processing Engineering Research Center, Daqing 163319,China；3.Futaste Pharmaceutical Company Limited, Yucheng 251200,China）Abstract：The separation technique of xylool

5、igosaccharides with simulated moving bed chromatography wasexplored in this paper. First of all，the stationary phase was chosen which was perfect for the separation by the way of single column experiment. Different types of ion-exchange resin were applied on the target of resolution and separation e

6、fficiency. And DIAION -UBK530Na resin was more effective compared to others. Then the simulated moving bed chromatography operation was implemented. On the assistance of true moving bedmodel，the initial operating parameters were established. Further additional optimization work was tried on thedirec

7、tion of theory. The optimum conditions were as follows：shift time interval was 300s， quantity of flow in the entrance and eluent were 3.5mL/min and 5mL/min，respectively. At the same time，the flux of the extract and raffinate were 3.8mL/min and 4.7mL/min，respectively. Besides，the circulating flow was

8、 kept within 8.9mL/min. Finally，we gained products with purity both more than 90%，yield coefficient of 91.55% and 92.18% respectively. Key words：simulated moving bed chromatography；xylooligosaccharides；resin；optimization文 章 编 号：1002-0306（2011）10-0310-04中图分类号：TS241文献标识码：B低聚木糖作为目前应用最广泛的功能性低聚糖之一，其独特的生理

9、活性和良好的理化特性已经得 到普遍的认可，在日本，超过半数的“特定保健食品” 种类中添加了低聚木糖1，因为它除了具有一般功能 性低聚糖的功效外，还有极好的耐热性，并且在酸性 条件（pH2.5）下也不分解，几乎100%到达肠道，对双 歧杆菌的增殖能力更强2。在低聚木糖的生产中，分离提纯一直是主要的技术难题之一，目前常用的方法有柱色谱分离法、膜分离法、酶分离法和微生物发 酵法等3。膜分离过程是依据滤膜孔径的大小使物质 通过或被截留于膜而达到物质分离的目的。由于制膜技术的限制，膜的截留孔径不是绝对的，而是一个 范围的平均值，再加上被分离糖液的浓度较高，因此 要达到较高的分离度往往需要较长的柱膜长度，

10、使分离过程变得不经济。酶分离法和微生物发酵法均 是对糖液中某一种或几种成分的去除，过程难以有 效控制，影响了工业化生产。色谱分离在糖类及其衍 生物的生产中是一种广为应用的单元操作，模拟移收稿日期：20101115 * 通 讯 联 系 人作者简介：孟娜（1984-），女，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学。动床色谱（SMBC）是连续色谱的一种，该分离技术自度和收率作为衡量工艺条件优劣的指标，从而确定20世纪60年代发展以来，以其分离能力强、设备体积小、投资成本低、便于实现自动控制并特别有利于分 离热敏性及难以分离的物质等优点，在连续性大规模工业化生产中的应用越来越广泛4。本文通过单柱固定床实

11、验，筛选出适合于低聚木糖分离的树脂，再 利用模拟移动床色谱（SMBC）对预处理后的含有低 聚木糖的原料液进行分离提纯，确定了最佳工艺条 件，为进一步扩大生产规模提供一定的参考。出较佳的操作条件。洗脱剂提取液区区区切换方向材料与方法11.1材料与仪器低聚木糖原料液 自制，玉米皮经酶水解；木糖、阿拉伯糖对照品 禹城福田药业有限公司；低聚木糖 对照品 95型，山东龙力生物科技有限公司；色谱分离 树 脂 PUROLITE -PCR642Ca、Amberlite -R1310Na、 DIAION-UBK530Na；乙腈 色谱纯；高纯水。单柱固定床装置 吸附柱（14mm2mm1200mm，不锈钢材质，带恒

12、温夹套）、平流泵、定量管、恒温水浴槽（精度0.5）、压力表、自动收集器；高效液相色 谱仪 Agilent1200，配有相应的泵和示差折光检测器 及色谱工作站；色谱柱 REZEX7.8300mm，8m Ca， 美国Phenomenex公司；模拟移动床分离设备 XZ12Z-提余液区图1 SMBC分离过程示意图进料液结果与讨论22.1合适树脂的选择糖分子是呈电中性的，它不具有离子的特征。如 果糖分子要与树脂发生作用，它首先要进入树脂中，一个葡萄糖分子的直径约为5.13魡，木糖分子的还要更小，而木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等低聚木糖分子均为线性分子，可以估计，大些的低聚木糖分子 直径约在28魡左右。

13、用来分离单糖或低聚糖等分子量 较小物质的树脂，一般都为凝胶型树脂。凝胶型树脂 具有均相凝结的结构，在溶胀状态下才显示出孔穴， 树脂颗粒的毛细孔径很小，一般为30魡以下，因此，不同的孔径就对不同的糖分子产生了选择，从而起到一种体积排阻效应；除此以外，树脂还通过静电固定 在强酸阳离子交换树脂上的金属阳离子和糖上的羟 基形成给体受体配合物。本 实 验 以 PUROLITE -PCR642Ca、Amberlite - CR1310Na、DIAION-UBK530Na三种离子交换树脂作 为分离介质，在相同的分析条件下比较其分离效果。 质量分数为35%的进料液经高效液相分析得低聚木 糖69.4%、木糖22

14、.4%、阿拉伯糖8.1%、杂糖0.1%，在进 样量为10mL，柱温70，高纯水做流动相，流速为1.4mL/min条件下得到的分离流出曲线如图2图4。1.2L，大庆宏源分离技术研究所；旋转蒸发仪EYELA；阿贝折光仪。1.2HPLC检测条件日本流动相：高纯水100% ；流速：0.6mL/min；柱温：38；进样量：10L。固定床吸附与洗脱实验将预处理后的树脂装入单柱中，开启平流泵向 其中注水，待将柱中空气排尽后，调节泵行程至所需 流速，同时开启恒温水浴和循环水泵，使吸附柱夹套 温度恒定于70，在六通切换阀取样位置，将质量分 数为35%的低聚木糖原料液加入定量管，把切换阀 切换至进料，同时开始计时

15、，当进料至10mL时，切换 阀切回，停止进料，以高纯水作为洗脱剂开始洗脱分离，待流出液中有分离组分流出时，开始采样，每管采 样体积3mL，直至流出液中糖的质量分数小于0.5%。1.4 模拟移动床分离低聚木糖的工艺本实验所用的模拟移动床分离设备是四区十二 柱系统，各区柱数分布不同，其示意图如图1，不同分 区的功能不同：区是洗脱区，其功能是将强吸附组分解吸；区是精馏区，在未进样条件下，继续用流 动相冲洗，相当于精馏；区是吸附区，其功能是将 强吸附组分吸附；区作用是将弱组分吸附，再生洗脱液（D），也相当于精馏。其中起主要分离作用的是 区和区，它们承担基本的分离任务，所以柱数相 对较多。柱色谱系统在相

16、应管路和驱动系统、传动系 统的衔接配合下，通过多通旋转分配阀的定子盘与转子盘来实现模拟移动与两相逆流的效果，达到分 离的目的。高浓度的进料液（F）从、区之间进入 SMB系统，提余液（R）为弱吸附组分低聚木糖溶液， 提取液（E）为强吸附组分，即含有木糖、阿拉伯糖等的单糖溶液，分别取样进行高效液相色谱分析，以纯1.33530252015105低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 杂糖024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78流出体积（mL）图2 PUROLITE-PCR642Ca树脂分离流出曲线在低聚木糖纯度达到90%以上的时候，不同树

17、脂作为分离介质分离后的收率情况如表1所示。因为不同性质、不同分子量的糖与金属阳离子形成配位络合物的情况不同，由以上对照可以看出， 不同树脂表现出了差异的分离效果。配合物越稳定， 此类糖分子就越受阻滞，而不形成配合物或是形成 很弱的配合物的糖分子很快就从柱中流出。于是，固 定在树脂上的阳离子形式成为影响低聚木糖分离过311 2011年第10期干物质质量分数（%）程的一个重要参数。不论哪种树脂，均是低聚木糖先式中：Q流量，mL/min；上下标：D洗脱液；分离出，说明低聚木糖是弱吸附组分，木糖、阿拉伯糖等单糖的性质相近，保留时间相对长，作为强吸附 组分后分离出；在达到90%纯度的前提下，DIAION

18、- UBK530Na树脂的分离度较好，得到的低聚木糖收率 也相对较高。所以选择该树脂作为模拟移动床色谱 柱中的填料，进一步探讨SMBC的分离效果。35F进料液；R提余液；E提取液；re循环液。2.2.2 SMBC分离提纯低聚木糖的条件优化 从经 济观点来看，操作参数的优化标准就是在提取液和提余液保持所需纯度和收率的前提下，使固定相和流动相的耗费量最少，即使单位产品的分离成本降 到最低水平6。设弱吸附组分低聚木糖（A）从提余液（R）出口 收集，强吸附组分单糖（B）从提取液（E）出口收集，并 分别定义其纯度和收率如下：A低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 杂糖30252015105100c提余液中A的纯度：

19、PR=RA BcR+cRBE100c024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69流出体积（mL）提取液中B的纯度：PE=A BcE+cEA图33530252015105Amberlite-CR1310Na树脂分离流出曲线100c QR提余液中A的收率：PR=RAcF QF低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 杂糖B 100c QE提取液中B的收率：PE=EBcF QF式中：PR提余液纯度，%；PE提取液纯度，%；c组分在液相中的浓度；Q流量，mL/min；上下标：A弱吸附组分；B强吸附组分；F进料液；R提 余液；E提取液。优化的目的在于确定各区最佳固液相

20、流量，以达到较高的生产效率，为了在提余液中回收弱吸附 组分低聚木糖（A），在提取液中回收强吸附组分木糖、 阿拉伯糖等单糖（B），必须满足一些约束条件：区 是组分B的解析区，洗脱剂会将固定相冲洗干净，使 其不将单糖带入区，因此要使Q大于单糖随固定 相移动的速度；区作为精馏区，要使Q介于低聚木 糖和单糖的移动速度之间，从而可在提取液出口得 到不含低聚木糖的单糖；区作为B组分的吸附区，要 控制Q使仅A组分低聚木糖随流动相移动，从而在 提余液出口得到较纯的低聚木糖；位于洗脱剂入口 和提余液出口之间的区有两方面的作用：一是吸 附组分A，使洗脱剂与新鲜的洗脱剂一起进入区， 达到循环利用的目的；二是将区和区

21、隔开，以免 提余液中的低聚木糖进入区而降低收率，起到了 一定的缓冲作用，因此要控制Q使其小于组分A的 移动速度，从而不会污染区。由此确定了一组分离 操作的初始条件，如表2所示，经检测分析AD、BD出 口中的A、B组分纯度都较低，收率也相对小，即两组 分分离程度不理想，然后按照SMBC的分离原理进行 了如下优化:优化1：增大循环流量，也就是区流量，改善低 聚木糖的吸附，使不进入区，分析发现两种组分的纯度均有所提高，但收率变化不大；优化2：减小AD流量，由流量关系公式可知Q增 大，提高了低聚木糖随流动相移动的速度，从而侧面 改善了提取液中单糖的纯度，使两种组分的分离度 有所提高；优化3：提高洗脱剂

22、流量，在循环流量不变的情024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72流出体积（mL）图4 DIAION-UBK530Na树脂分离流出曲线表1 不同树脂对低聚木糖和单糖分离性能的影响流速（mL/min）低聚木糖收率（%）树脂类型分离度PUROLITE-PCR642CaAmberlite-CR1310Na0.430.5556.4566.901.4 DIAION-UBK530Na 0.55 68.33 2.2 模拟移动床实验2.2.1 SMB模型的选择 模拟移动床色谱分离过程 的基础是柱过程，柱过程在高浓度进料条件下为非线性过程，考虑各种扩散

23、及相间传质阻力，其特征为非理想非平衡，而SMB是柱的串联组合，是一个多区 带系统，每带流速不同，系统周期性地连续运行，所 以总体来说，是一个非线性、非理想、非平衡、多自由 度的周期过程。对于这类复杂的连续过程，无论是初 始分离条件的选择，还是中间过程的控制，都要通过 多个参数的调节来实现，而实现这种选择与调节都 必须依赖SMB的数学模型5。精确的SMB模型需要明确考虑循环切换操作， 其数学关系式复杂，为分析方便，本实验采用不计孔内过程的色谱模型，即采用基于等价的真实移动床（TMB）近似，把切换时间转换成固相流速，忽略循环 口的切换，得各分区流量关系如下：QFQD=QEQRQ=QreQD Q=Q

24、reQDQE Q=QreQDQFQE Q=Qre312 2011年第10期干物质质量分数（%）干物质质量分数（%）况下，区流量增大，从而将强吸附组分单糖充分解DIAION-UBK530Na树脂作为固定相，高纯水作为流吸，提高了其收率和纯度。优化4：在纯度和收率满足一定标准的前提下， 为了提高生产效率，就可以适当加大进料流量，从而 体现SMBC作为连续操作工艺优于分批操作的特点， 为工业化大规模应用提供一定的参考。表2 SMBC分离提纯低聚木糖条件优化过程动相，分离预处理后的含有低聚木糖的溶液，通过优化分离条件，在阀切换时间为300s、进料流量和洗脱 流量分别为3.5mL/min和5mL/min

25、、提取液和提余液 流量分别为3.8mL/min和4.7mL/min、同时循环流量控 制在8.9mL/min 的工艺操作下，使分离后的低聚木 糖、单糖纯度均在90%以上，收率分别达到91.55%和92.18%。由此得到的低聚木糖纯度高、收率大，且工 艺操作简单，处理量大，生产成本相对较低，适合于 工业化规模的应用。参考文献初始 条件操作参数优化1优化2优化3优化4切换时间（s）进料流量（mL/min） 洗脱流量（mL/min） AD流量（mL/min） BD流量（mL/min） 循环流量（mL/min） 低聚木糖（%）30034.52.94.68.421.8475.3520.7582.4887.

26、647.3111.7530034.52.94.68.916.0881.9819.7583.9192.714.4813.0085.2730034.52.84.78.914.583.3219.388.7590.355.8713.2590.04300353.84.28.96.1388.1118.2593.4592.436.9213.190.973003.553.84.78.97.8390.0518.2592.1891.655.7413.0091.551 张 军 华 ，徐 勇 ，勇 强 ，等 .低聚木糖分离纯化的研究进展 J.中国生物工程杂志 ，2004，24（8）：25-28.2 石 波 ，李 里

27、特 .功能性添加剂木寡糖的制备研究 J. 国 外 畜 牧 科 技 ，2000，27（6）：14-17.3 李 健 ，刘 宁 ，吴 艳 华 ，等 .低聚糖分析技术研究 J.哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 ，2003，19（1）：75-79.4 蔡 宇 杰 ，丁 彦 蕊 ，张 大 兵 ，等.模拟移动床色谱技术 及 其 应 用J. 色 谱 ，2004，22（2）：111-115.5 林 炳 昌 .模拟移动床色 谱 技 术 M. 北 京 ： 化学工业出版社 ，2008.6 徐 玲 ，彭 奇 均 ，蔡 宇 杰 ，等.SMB色谱分离过程的建模与优化 J.华东理工大学学报 ，2002，28（3）：300

28、-304.单糖（%）浓度（Brix%） 单糖收率（%） 低聚木糖（%） 单糖（%） 浓度（Brix%）ADBD低聚木糖收率（%） 83.25结论本实验采用模拟移动床色谱 （SMBC） 技术，以3!（上 接 第309页 ）度、时间和料液比对牛磺酸提取量的影响都达到了极显著水平（p0.01），加酶量在实验因素水平范围 内对实验没有显著性影响。正交实验中最适宜酶解工艺组合为A1B2C2D2，因素A、C、D对牛磺酸提取量都 有显著性影响，因此因素A取40，因素C取7.2，因素D 取19（g/L）；因素B对实验无显著性影响，且加酶量从1000u/g到1200u/g，牛磺酸含量相差不大（加酶量为1000u

29、/g时牛磺酸提取量为2.623mg/g，加酶量为1200u/g时牛磺酸提取量为2.628mg/g），考虑到节省成本，选 取加酶量为1000u/g（鲜肉）。综上所述，中性蛋白酶酶 解提取牛磺酸的最适宜工艺为：温度40，加酶量1000u/g（鲜肉），pH7.2，料液比19（g/L）。表3 中性蛋白酶酶解实验方差分析条件下水解5h，牛磺酸提取量为2.623mg/g（鲜肉）。参考文献1 鲍 建 民.牛磺酸的生物功能研 究 进 展 J.食 品 与 药 品 ，2006，8（5）：18-20.2 谭 乐 义 ，章 超 桦 ，薛 长 湖 .牛磺酸的生物活性及其在海洋生 物 中 的 分 布J.湛江海洋大学学报

30、，2000，20（3）：75-79.3 Staplcton P P，oflahcrty L，Rcdmond H P，et al. JPEN J ParchtcrEntcral Nutr，1998，22（l）:42-48.4 俞 鸣 ，田 庆 伟 .牛磺酸保健作用的研究进展 J.中 国 食 品 添 加 剂 ，1999（4）：4-7.5 申 淑 琦 ，徐 春 霞 ，佟 瑞 山. 牡蛎的营养保健功能及其开发利 用J.河 北 农 业 科 学 ，2009，13（10）：79-81.6 杜 引 娣 ，刘 培 贤. 牛磺酸的研究现状与前景J. 临 床 医 药 实践 杂 志 ，2004，13（1）：6-7.7

31、 桂 利 ，李 瑞 声 .牡蛎的化学成分和药用价值 J.中 国 海 洋 药 物 杂 质 ，1999（4）：26-31.8 汪 何 雅 ，杨 瑞 金 ，王 璋 .牡蛎的营养成分及蛋白质的酶法水 解J.水 产 学 报 ，2003，27（2）：163-168.9 杨 广 会 ，周 艳 霞 ，徐 晓 莉.鱿鱼中牛磺酸的 提 取 工 艺 研 究 J.食 品 工 业 科 技 ，2010，31（6）：215-217.10 粟 桂 娇 ，阎 欲 晓 ，覃 洁.车螺肉酶解液中提取分离天 然 牛 磺 酸 工 艺J.食 品 科 学 ，2005，26（9）：372-376.11 汤 志 方 . 海洋生物中牛 磺酸的提

32、取及分析 D. 湛 江 :中 国海 洋 大 学 ， 2005: 16-24.变异来源平方和SS自由度df均方MsF值P值AB C D误差总计1.7460.0040.1020.0510.02377.85822229180.8730.0020.0510.0250.003335.0050.78319.4809.7830.000.4860.0010.006结论本文研究了中性蛋白酶酶解牡蛎提取牛磺酸的 工艺条件，得出影响牛磺酸提取量的主次因素是温 度、pH、料液比、加酶量。最佳工艺条件为：温度40， 加酶量1000u/g（鲜肉），pH7.2，料液比1:9（g/L），在此3313 2011年第10期file:/C|/Users/Administrator/Desktop/新建文本文档.txt涵盖各行业最丰富完备的资料文献，最前瞻权威的行业动态，是专业人士的不二选择。file:/C|/Users/Administrator/Desktop/新建文本文档.txt2012/8/26 12:19:58