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1、酶膜生物反应器中酶的固定化方法研究及其应用进展310药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2006,13(4):310314酶膜生物反应器中酶的固定化方法研究及其应用进展石陆娥,应国清,唐振兴,易喻,熊文悦(1.浙江工业大学化材学院博,杭州310014;2.浙江工业大学药学院,杭州310014)摘要利用膜作为固定化酶载体的酶膜反应器,能有效地将酶固定,可实现产物的原位分离,消除位阻效应和抑制效应,且可连续操作,便于放大,已广泛应用于蛋白质,纤维素,淀粉等的酶解,污水处理等.文章对酶膜反应器中的固定化方法研究进行了分类,介绍并综合了酶膜反应器的应用,及存在问题.对其前

2、景做了展望.关键词固定化酶;酶膜反应器;膜分离中图分类号:Q814文献标识码:A文章编号:10058915(2006)04031005酶作为生物催化剂,已广泛用于制药,食品,生化行业.而其有效性和经济性在很大程度上取决于酶与反应物的接触方式和能否以恰当的方法将酶与产物分开.吸附,包埋,共价交联,微束等固定化酶技术的迅速发展,改变了酶工程学的面貌近几十年来,膜分离技术已经渗透到生物化工领域,它不仅能有效地对酶,蛋白质,生物制品等进行分离,浓缩和纯化,还能利用膜作为固定化酶的载体,实现酶的膜固定化.传统意义上的膜固定化酶反应器,通常是将一种不能透过高分子化合物的分离膜置入容器中,然后加入酶及底物,

3、使其进行酶反应,其反应生成物会连续不断地透过分离膜,而被回收利用.这种酶虽然也被称为固定化酶,但因酶和膜相对独立,酶和膜的特征实质没有改变,因而酶在游离态时的一些缺陷如稳定性差,使用寿命短等并未得到改善.目前随着酶固定化技术和水平的提高,膜科学技术和工业的不断发展,各种膜固定化酶反应器不断涌现,其克服了游离酶膜反应器的缺点,成为目前酶工程领域的研究热点.国际已开始用以生产卜天冬氨酸,卜苹果酸,氨基青霉烷酸,酒精等.国内对酶膜反应器的研究刚刚起步.它的研究开发将有助于推动我国酶工程学的发展.1酶膜反应器中酶的固定化方法随着膜固定化技术的发展,特别是当半透膜除了用于分离外,还被用作界面催化剂的载体

4、制各膜固定酶时,酶膜反应器的功能得到了拓展,因为在反应体系中多了一个固定相,可以进行更复杂的酶反应,例如可以实现多相酶反应体系将酶固定在膜上的方法有物理吸附法,化学交联法,共价结合法,定点固定化等.1.1物理吸附法(凝胶层固定化)膜(或经适当处理过的膜)对膜蛋白有较强的吸附作用,借助膜的这种特性将酶溶液在膜反应器中循环一定时间后便可实现酶的固定化.酶溶液进行膜过滤后,因浓差极化而在膜表面形成一薄层酶蛋白凝胶层,这也属于吸附法固定酶的一种方法(动态固定化).或者酶被无催化活性的蛋白质包围在膜表面形成凝胶层,这种方法称为共凝胶化固定法(静态固定化).这种固定化法由于酶处于微细环境中,十分稳定,酶的

5、失活较小,并且胶层内酶浓度较高,因而反应物的转化率也较高.但缺点是膜易被堵住.此法关键是选择有适当的截留分子量的超滤膜和膜组件构型.这种反应器的应用见表l.表1凝胶酶膜反应器1酶反应物及用途酸性磷酸酶卢一葡糖苷酶卢一葡糖苷酶一半乳糖脱氢酶蔗糖酶苹果酶脂肪酶脲酶变构酶青霉素酰化酶磷酸4一硝基苯脂水解纤维素二糖水解为葡萄糖4一硝基苯基葡糖苷D一半乳糖的氧化蔗糖L一苹果酸转化为丙酮酸脂肪水解尿素分解CMP的氨基水解青霉素除去侧链成6一APA收稿日期:20060421修回日期:20060521基金项目:浙江省科技厅资助项目(2005C33004)作者简介:石陆娥,女,1979年9月生,浙江新昌人,博士

6、生,从事酶的固定化,分离纯化等的研究.*通讯联系人:email:gg坠g!:塑联系电话:057188320803802石陆娥等:酶膜生物反应器中酶的固定化方法研究及其应用进展3111.2化学交联法膜材料上不存在反应基团时,通过双功能或多功能试剂的架桥作用,使酶与功能试剂形成共价键而实现酶固定化.常用的试剂有戊二醛,双重氮苯胺和乙烯一马来酸酐共聚物等.主要步骤是:1)用硅烷化试剂活化膜:2)用双功能试剂与活化后的膜反应:3)在低温下把酶固定在膜上.其应用见表2.表2交联酶(均以戊二醛为交联剂)1.膜材料酶丝素丝素丝蛋白醋酸纤维素鸡蛋白聚碳酸脂PVC一硅石甲基丙烯酸甲酯一二甲基丙烯酸乙酯糖化酶卢一

7、葡萄糖糖苷酶葡萄糖氧化酶胆固醇氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶a淀粉酶胰脂肪酶1.3共价偶联法膜表面含有活性基团时,酶与基团以共价键方式结合,从而实现酶的固定化.这种方法固定的酶,结合牢固,半衰期长,但对于常用的中空纤维膜(聚砜膜,聚丙烯酰膜等)不太适用,还需对膜进行修饰.共价偶联法的缺点是对酶的活性影响较大.具体包括以下三种方法:1)叠氮法:叠氮法适用于表面带羧基或羧甲基的膜材料.如羧甲基纤维素经酯化后,用水合肼处理得到酰基肼,再用亚硝酸处理制成叠氮衍生物,可与酶分子上的氨基,羟基等基团反应制成固定化酶膜.2)戊二醛法:戊二醛与膜材料上的氨基反应,生成具有醛功能的模板,再与酶蛋白上的氨基作用实

8、现酶的固定化.3)共价固定法:如利用载体上的缩醛结构与酶分子上的氨基缩合;利用载体活化后形成的异氰酸或异硫氰酸衍生物与酶分子共价结合;利用溴化氰法,烷化法,碳二亚胺活化法固定化酶等.共价结合法固定的酶稳定性高,但由于固定化过程反应激烈,酶失活较严重,且载体不易再生.其应用见表1.4利用相变法把酶或整个细胞包埋在膜的微孔结构内.即将酶混入铸膜液中,经相变法形成凝胶膜或呈多孔海绵结构的不对称膜,使酶包埋其中.也可将酶充填在中空纤维膜的多孔区,然后再用复合膜使之封闭.但这些酶必须耐热,对化学试剂稳定.表4为包埋生物催化剂膜.表3共价偶联酶膜4膜材料酶共价偶联法丝蛋白葡萄糖氧化酶溴化氰或戊二醛醋酸纤维

9、素胆固醇氧化酶戊二醛改良醋酸纤维素糜蛋白酶溴化氰聚乙烯氟一改良纤维素多种酶溴化氰胶原葡萄糖氧化酶酰叠氮改良聚砜脲酶重氮化MRD2370葡萄糖氧化酶酰叠氮改良聚砜葡聚糖酶戊二醛改良尼龙脲酶重氮化尼龙胰蛋白酶碳二亚胺聚乙烯醇多种酶重氮化毛细管膜果糖转移酶戊二醛聚丙稀腈假单孢菌戊二醛有机膜n一胰凝乳蛋白酶戊二醛表4包埋生物催化剂膜膜材料生物催化剂醋酸纤维醋酸纤维丝素聚乙烯纯聚砜聚砜醋酸纤维素聚丙烯酰胺不对称毛细管膜聚丙烯酰胺聚亚安酯聚丙烯酰胺氨基酰化酶脲酶糖化酶半乳糖苷酶转化酶硫化叶菌caldariellaacidophila天门冬氨酸酶延胡索酸酶天(门)冬氨酸酶与大肠杆菌精氨酸酶和天(门)冬酰胺酶

10、青霉素酰化酶1.5将酶固定于中空纤维膜组件的壳层内1即酶液或与交联剂一同在无菌条件下采用反冲的方法进入中空纤维膜组件的壳层或膜的多孔壁中.反应物以扩散或以对流的形式进入膜中,即在酶的催化作用下进行反应,然后生成物再以扩散或对流形式离开膜.1.6定点固定化技术(sitespecificimmobilization)L传统的固定化方法一随机固定化(randomimmobilization)常导致酶活力下降.这主要是因为酶蛋白常常通过赖氨酸残基上的一氨基与载体活性基团偶合,酶表面分布有多个赖氨酸残基,与载体作用时可以采取多种空间取向,酶蛋白多点附着在载体上,结构变异,增加了底物接近酶活性中心时的空间

11、位阻,使酶活力下降:同时,酶固定量312药物生物技术第13卷第4期受到限制.定点固定化技术借助分子生物学方法,能有效克服这一弊端.即通过酶蛋白上的特定位点与膜载体作用,在膜表面形成一种高度有序的酶分子的二维阵列.酶蛋白上的作用位点远离催化活性中心,使底物能充分接近活性中心.与随机固定化方法相比,酶的活力和固定量都有显着提高.定点固定化方法主要有3种:1)抗体偶联法.2)生物素一亲和素亲和法.即将生物素融合在酶的N一末端或C一末端,利用生物素一亲和素的亲和性,在固定有亲和素的膜材料上实现定点固定.Vishwanath等利用此法将一半乳糖苷酶定点固定在聚醚砜膜上,酶活力比随机固定化提高近20倍;3

12、)氨基酸置换法.即借助基因突变技术,将半胱氨酸引人酶分子,利用半胱氨酸残基上的巯基在膜材料表面实现定点固定化.1.7酶先固定化,再在酶膜反应器里进行反应m此处酶的固定化有常规的各种固定化方法.第一大类是载体结合法.载体结合法是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法.根据结合的形式不同,又可分为物理吸附法,离子结合法和共价结合法等.第二大类是交联法.第三大类是包埋法.此法可分为网格型和微囊型两种,将酶包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型,将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型.包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶,因为只有小分子才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散.适于网格型的高分子化合物有聚丙

13、烯酰胺,聚乙烯醇,淀粉,明胶,海藻酸等.2酶膜反应器的应用采用酶膜反应器,可以实现酶反应的连续操作,提高产物得率.酶膜反应器常用在大分子的水解,辅基再生系统的共轭反应,脂酶催化的水解与合成,逆向胶团催化,污水处理等.2.1大分子的水解主要是指蛋白,糖类(淀粉和纤维索),肽类,麦芽糊精等大分子的水解.利用膜的筛分作用,可以将相对分子质量较大的生物大分子与相对分子质量较小的水解产物实现原位分离,以部分甚至全部消除产物抑制,这就要求采用超过滤型反应器,使酶和底物直接接触.酶膜反应器还可以用来控制反应的深度.由于膜污染和产品附加值低,酶膜反应器没有得到充分有效的利用.这方面的应用实例多集中在农业一食品

14、领域,包括:(1)透过果胶水解来降低果汁粘度_1.;(2)通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳清中乳糖的含量m;(3)通过多酚化合物和花色素的转化来进行白酒的处理;(4)从牛奶产品中去除过氧化物等.2.2辅基再生系统的共轭反应酶膜反应器越来越多地用于不同纯度的化合物包括光学活性物质的合成.有些酶在进行反应时需要辅因子如NAD+,NADP,辅酶或ATP来协助完成共价键生成,能量传递,基团转移和氧化还原反应.但是,这些辅因子通常价格昂贵,所以在实际生产中应用酶膜反应器来实现辅基的再生可较好地解决这一问题.酶膜反应器使辅基再生,一般是采用一共轭酶系统或共轭底物法.辅酶的需要量只要满足反应所需

15、量即可.采用共轭酶系统,要求有辅基再生酶和较便宜的辅助底物.此酶利用辅助底物生成主反应消耗掉的辅基.选择辅基再生酶时,关键要考虑副产物去除的难易和反应平衡.醇,乳酸或葡萄糖脱氢酶都常被选用为辅基再生酶.采用共轭底物法,即一种酶催化两种不同的底物,一反应产生的辅基补充另一反应辅基的消耗.如在醇脱氢酶合成外激素的主反应中,可由另一辅助底物异丙醇在同种酶的催化下生成主反应所需的NADP.根据反应器的构造和膜的多孔性,辅基可通过共价键结合到聚合物如PEG上,使其截留在膜的一侧,通过分子筛或静电斥力固定或处于游离状态.这种辅基再生反应器可用来合成如NADPH,氨基酸,含氧酸,醇,酸,6一磷酸葡萄糖,乙醛

16、,乳酸酯和内酯等.大规模的生产应用如以丙酮酸为底物在L一丙氨酸脱氢酶的作用下生成L一丙氨酸.通过副反应甲酸脱氢酶氧化甲酸实现NAD到NADP的再生.NADP固定在PEG上.每一辅基分子循环利用可达500000次.酶膜反应器能较易地实现多种酶的同时固定.这对多酶催化的顺序反应很有意义.有学者报道了酶膜反应器在两种酶顺序反应中的应用.如Kragl等用表异构酶先将N一乙酰葡糖胺异构化为乙酰甘露糖胺,然后添加丙酮酸,由裂解酶催化得到终产物.用淀粉生产麦芽糖浆采用卢一淀粉酶/异淀粉酶和一淀粉酶/葡糖淀粉酶双酶系.2.3脂酶催化的水解E2o,21和合成反应脂酶的特殊结构和作用机制,即其在相界面激活起作用使

17、得在酶膜反应器尤其是在多相酶膜反应器中脂酶的活性显着提高,因为这有利于酶和底物的界面接触.可以油脂为底物分解生成脂肪酸,单/双甘油酯和甘油,或者合成酯类(包括酯交换反应).这类反应器,膜的一侧是油相(有机相),另一侧缓冲液不停流动.疏水性的膜材被油相浸湿,亲水性的膜材被水相浸湿,反应在界面上发生.脂酶可固定在膜的一侧.Tanigaki有一改进方法,用两块分别是亲水的和疏水的膜隔离出一酶反应室.水通过亲水膜进入反应室:大豆油通过疏水膜渗透人反应室,生成的甘油和脂肪酸重新通过膜扩散回水相,油相再循环.脂肪酶及酯酶,青霉素酰化酶和腺苷胶氨基酶可进行光谱纯药物的合成.在手性药物的制备时,这些酶区别作用

18、于外消旋的对映体的特性使它们优越于传统的化学合成【2.随着制药的发展,酶膜反应器必将在手性药的大规模生产上发挥作用.已有采用中空纤维膜对脂肪酶催化石陆娥等:酶膜生物反应器中酶的固定化方法研究及其应用进展313的环氧丙基丁酸酯对映体进行分离.2.4逆向胶团催化通过逆向胶团体系将酶微胶囊化,采用酶膜反应器进行的酶反应,其主要限制因素是反应体系中的表面活性剂带来的污染.这使产物的分离纯化及酶的回收变得困难.利用酶膜反应器截留含酶逆向胶团及分离产物,已被公认为逆向胶团酶反应技术工业化最有前途的方法_2.超滤酶膜反应器的合成半透膜能高效地截留反相胶团(含酶或不含酶)和分离产物,同时保留逆向胶团体系的独特

19、反应优点.但是,膜不能完全截留表面活性剂单体和水合胶团,给产物流带来污染.Khmelnitsky等把含酶的反相胶团聚合,在酶膜反应器采用这样的酶体系,可避免表面活性剂对产物的污染,实现产物分离.2.5污水处理Bodzek等研究了酶法去除可乐工业污水中的苯酚和氰化物.他们把酶固定在超率膜上,虽然处理时间比较长,但效果比较好.Edwardsl2等研究了酚类混合物(苯酚,甲氧基苯酚,甲酚等)的降解,通过把多酚氧化酶固定到聚砜毛细管膜上,虽然酶活有所降低,但酶膜生物反应器表现出了良好的氧化能力,而且很容易把产物从污水中分离出来.Edwards等还将多酚氧化酶固定在涂附有脱乙酰壳多糖胶层的聚砜膜上,于酶

20、膜反应器内氧化水中的酚类化合物.脱乙酰壳多糖胶层不仅能够有效增加载酶量,减少反应产物对酶的抑制作用,从而提高反应效率,而且还有利于水的脱色.Jolivalt等报道了固定化漆酶在酶膜生物反应器中分解污水中苯基尿素杀虫剂.固定化后酶活更加稳定,处理能力更强.还有报道用固定化酶膜生物反应器去除污水中的苯磷二酚和苯酚_2.3存在问题及发展方向存在问题:(1)不均匀流动分布限制了酶膜反应器的应用,尤其在中空纤维管道中,催化剂的分布及其不均匀,例如在啤酒酵母的研究中,某些中空纤维管道里几乎没有细胞.(2)酶或细胞间作用及其与膜的相容性及反应器中膜与酶或细胞问的相互作用既与疏水性和表面电荷有关,也有可能是表

21、面化学所引起的.总结包埋酶的各种膜的影响,尚未发现指导膜材料选择的一般规律.如聚砜膜可以使某些酶失活,如J8一半乳糖苷酶,0t一半乳糖苷酶和葡萄糖异构酶,而丙烯酸膜不会使这些酶失活.但聚砜膜对蛋白酶和霉菌的乳糖酶却毫无影响.但对酵母的乳糖酶有影响.这些问题都尚待解决.(3)膜的机械损伤问题长期生产中,膜的物理损伤很严重,压力较大时容易使膜破裂或崩解.(4)膜污染进料中带入的悬浮物质,以胶体状存在的物质以及微生物等都会在膜上形成覆盖层,这就是通常所说的膜污染.这种在操作过程中形成的覆盖层是实际工作中经常遇到的最大问题,使膜反应器的应用受到限制,急需更优的方法来解决这个问题.这是膜式酶反应器应用中

22、的主要问题.酶膜反应器是未来酶生物反应器发展的方向之一.其发展趋势有:(1)将电压作为溶质跨膜输送的推动力,并用于酶膜反应器的辅基再生技术;(2)研究超滤膜截留固体产物的能力,在生成不溶产物的反应中使用酶膜反应器;(3)在多酶顺序反应体系中应用酶膜反应器;(4)采用酶膜反应器生成手性药物;(5)在纵深方向提高酶膜反应器的效率;(6)开发耐溶胀的膜材料.在酶膜反应器中,由于有机溶剂的引入,常使膜发生溶胀,膜的弯曲因子,孔径等发生改变,致使机械强度降低.另一方面,溶胀使膜靠在一起,丧失有效的传质面积.因此,开发耐溶胀的膜材料成为酶膜反应器发展的关键之一;(7)研制新型膜材料.提高膜材料与酶分子之问

23、的相容性,减轻膜的污染,同时用模板技术或分子印迹技术进行膜结构尺寸的调变,降低扩散阻力是另一个膜材料重要发展方向.参考文献1IiuzM,DubremetzJF,RichardV,eta1.Usefulmethodforthespatiallocalizationdeterminationofenzyme(peroxidase)distributiononmicrofihrationmembraneJ.JournalofMembraneScience,2005,267(1-2):2-7.2PugazhenthiG,KumarA.Enzymemembranereactorforhydrolysis

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37、chydrolysisofprotein,starch,cellulose,etc.Differentclassificationandapplicatlonresearchesofenzymemembranereactorarereviewedandfutureprospectsareforecasted.Allkindsofimmobilizationmethodinimmobilizedenzymemembranereactorwareintroduced.KeywordsImmobilizationenzyme,Immobilizedenzymemembanereator,MembraneseDaration