分子生物学-遗传物质的分子结构和性质课件.ppt

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1、第二章,染色体与,DNA,?,遗传物质的分子结构和性质,?,基因组和染色体,?,DNA,的复制,?,DNA,损伤与修复,?,重组和转座,第一节,核酸的分子结构,1869,年,J.T.Miescher,发现,核素,（,muclein,）,?,米歇尔在作博士论文时要确定淋巴细胞蛋白质,的组成，不想却发现了一种既不溶解于水、醋,酸，也不溶解于稀盐酸和食盐溶液的未知的新,物质，最终证实这种物质存在于细胞核里，便,将它定名为“核质”。后由瑞典著名生化学家,阿尔特曼建议将“核质”定名为“核酸”。,?,1885,1900,年间，,Kossel,、,Johnew,、,Levene,证实核酸由,不同的碱基组成。

2、其最简单的,单体结构是碱基,-,核糖,-,磷酸构,成的核苷酸。,1929,年又确定了,核酸有两种，一种是脱氧核糖,核酸,(DNA),，另一种是核糖核,酸,(RNA),。,Phoebus Levene,这五种碱基的结构如图,?,核,酸,分,子,中,还,发,现,数,十,种,修,饰,碱,基,（,the,modified,component),又,称,稀,有,碱,基,，,(unusual,component),。它是指上述五种碱基,环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、,甲硫基化等）修饰后的衍生物。,DNA,中的修饰,碱基主要见于噬菌体,DNA,，,RNA,中以,tRNA,含,修饰碱基最多。,?,戊

3、糖,:,?,RNA,中的戊糖是,D,核糖，,?,DNA,中的戊糖是,D,2,脱氧核糖。,?,D,核糖的,2,所连的羟基脱去氧就是,D,2,脱氧核糖。,?,核,苷,（,nucleoside),：,由,D,核糖或,D,2,脱氧,核糖与嘌呤或嘧啶通过,糖苷键连接组成的化合,物。核酸中的主要核苷,有八种。,?,核苷酸,(nucleotide),：核苷与磷酸残基构成的化,合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的,结构单元。核苷酸中戊糖上的所有游离羟基均,可与磷酸形成酯键，但生物体内多数核苷酸的,磷酸连接在核糖或脱氧核糖的,C-5,上，形成,5,-,核苷酸。,?,DNA,分子中是含有,A,、,G,、,C,

4、、,T,四种碱基的脱,氧核苷酸；,RNA,分子中则是含,A,、,G,、,C,、,U,四,种碱基的核苷酸。,5,磷酸腺苷的结构式,?,含,有,1,个,磷,酸,基,团,的,核,苷,酸,称,为,核,苷,一,磷,酸,（,NMP,），含有,2,个磷酸基团的核苷酸称为核苷,二磷酸（,NDP,），有,3,个磷酸基团的核苷酸称为,核苷三磷酸（,NTP,）。如,AMP,是腺苷一磷酸，,GDP,是鸟苷二磷酸，,CTP,是胞苷三磷酸。,DNA,的一级结构,?,四种脱氧核苷酸按一定的排列顺序，以,3,5,-,磷酸二酯键相连接，形成多聚脱氧核,苷酸链，即,DNA,。,?,DNA,的一级结构是指,DNA,分子中核苷酸,的

5、排列顺序及其连接方式。,?,DNA,分子中脱氧核苷酸的连接有严格的,方向性，前一个脱氧核苷酸的,3,-,羟基（,-,OH,）下一个脱氧核苷酸的,5,-,磷酸形成,3,，,5,-,磷酸二酯键，从而构成一个没有分支,的线性大分子，其两个末端分别是,5,-,末,端（游离磷酸基）和,3,-,末端（游离羟,基）。,?,寡核苷酸（,oligonucleotide),：这是与核酸有关的文献,中经常出现的一个术语，一般是指二至十个核苷酸残基,以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。,?,但在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规,定，在不少文献中，把含有三十甚至更多个核苷酸残基,的多核苷酸分子也称作寡核

6、苷酸。,?,寡核苷酸目前已可由仪器自动合成，它可作为,DNA,合,成的引物（,primer),、基因探针（,probe),等，,核酸链的简写式,?,字符式：,?,用英文大写字母缩写符号代表碱基，,?,用小写英文字母,P,代表磷酸残基。,?,核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱,基和磷酸相间排列即可。,?,简写式中出现就视为,DNA,链，出现则视为,RNA,链。,?,以,5,和,3,表示链的末端及方向，分别置于简写式的左,右二端。,?,5,p,p,p,p,p,p,p,p,p,3,DNA,5,p,p,p,p,p,p,p,p,p,3,RNA,?,此式可进一步简化为：,?,5,p,3,5,

7、p,3,?,上述简写式的,5,末端均含有一个磷酸残基（与,糖基的,5,位上的羟基相连）,3,末端含有,一个自由羟基（与糖基的,3,位相连）,若,5,端不写，则表示,5,末端为自由羟基。,?,双链,DNA,分子的简写式多采用省略了磷酸残基,的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链,（,complentary strand),即可，链间的配对碱基,用短纵线相连或省略。,?,5,3,3,5,?,线条式：在字符书写,基础上，以垂线（位,于碱基之下）和斜线,（位于垂线与之间）,分别表示糖基和磷酸,酯键。,?,斜线与垂线部的交点,为糖基的,3,位，,斜线与垂线下端的交,点为糖基的,5,位。,DNA,的一

8、级结构,?,DNA,的一级结构是指,DNA,分子中核苷酸的排,列顺序，,DNA,顺序（或序列）是这一概念的简,称。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，,故可称为碱基顺序。,?,DNA,分子中不同排列顺序的,DNA,区段构成特,定的功能单位，这就是基因，不同基因的功能,各异，各自分布在,DNA,的一定区域。,DNA,的二级结构,双螺旋结构,?,(1),主链,(backbone),：由脱氧核,糖和磷酸基通过酯键交替连接而,成。主链有二条,它们似“麻花,状绕一共同轴心以右手方向盘旋,相互平行而走向相反形成双螺旋,构型。主链处于螺旋的外侧,这,正好解释了由糖和磷酸构成的主,链的亲水性。,所谓双螺旋就

9、是,针对二条主链的形状而言的。,?,(2),碱基对,(base,pair),：碱,基位于螺旋的内则,它们以,垂直于螺旋轴的取向通过糖,苷键与主链糖基相连。同一,平面的碱基在二条主链间形,成碱基对。配对碱基总是,A,与,T,和,G,与,C,。碱基对以氢键,维系，,A,与,T,间形成两个氢,键。,?,(3),大沟和小沟：,?,a,核苷酸间磷酸二酯键的,走向决定多核苷酸的方向，,一条从,5,-3,，一条从,3,-5,。,链间有螺旋型的凹槽，其中,一条较浅叫小沟，一条较深，,叫大沟，,?,b,大分子物质可到大沟中识别信息，主要是蛋白质结合的,部位。,?,c,小沟可进入水分子，维持,DNA,结构的稳定性

10、。,?,(3),大沟和小沟：,B,型,DNA,仅,仅,是,众多,DNA,双螺旋,构象中的一种。,在外界条件的改,变下，双螺旋的,构象也会改变。,双螺旋结构的构象变异,?,DNA,的构象现已知有,:A,，,B,，,C,，,D,，,E,，,L,，,P,S,Z,9,种。,?,引起,DNA,双链构象改变有以下因素：,（,1,）核苷酸顺序；,（,2,）碱基组成；,（,3,）盐的种类；,（,4,）相对湿度。,P-DNA,DNA,结构的多态性,?,A-DNA,和,B-DNA,结构的多态性,?,1.,在溶液中，,DNA,为,B,型，当水合的,B-DNA,脱水，或由于,加入乙醇或盐而使水的活度降低时，就转变为,

11、A,型。,?,2.,B-DNA,中，,2-,脱氧核糖的构象出现了变化，使同股多核,苷酸链中相邻磷酸基间的距离缩短,0.1nm,，使每匝螺旋的碱,基对数由,B-DNA,的,10,（溶液中为,10.5,）转变为,A-DNA,的,11,。,?,3.,在,B-DNA,中，碱基对集中于螺旋轴，在,A-DNA,中，碱基对,向大沟方向移动了,0.5nm,，从而改变了,B-DNA,的外形和沟的,尺寸。由于大沟、小沟是,DNA,行使功能时蛋白质的结合位点，,所以由,B-DNA,变为,A-DNA,后,Pr,对,DNA,分子的识别也发生了相,应的变化。,?,4.A-T,丰富的,DNA,片断常呈,B-DNA,，若,D

12、NA,双链中,一条链被相应的,RNA,所替换，会变构成,A-DNA,。,?,5.,当,DNA,处于转录状态时，,DNA,模板链与由它转录,所得的,RNA,链间形成的双链就是,A-DNA,，故,DNA,的构象对基因表达有重要意义。,?,6.,B-DNA,双链都被,RNA,所取代而得到由两条,RNA,链组成的双螺旋结构也是,A-DNA,。,Z-DNA,的发现,?,1972,年,Pohl,et,al,发现,poly(dG-dC),在高盐下旋光性发生改变；,?,1979,年,Wang,A.H-J,(,王惠君,),A.Rich,对,d(CGCGCG),单晶作,X,衍射分析提,出,Z,DNA,模型,.,左

13、旋,DNA,（一）,Z-DNA,的结构特点：,?,糖磷骨架呈“之”字形,（,Zigzag,）走向。,?,左旋。,?,G,残基位于分子表面。,?,分子外形呈波形。,?,大沟消失，小沟窄而深。,?,每个螺旋有,12bp,。,Z-DNA,B-DNA,Z,DNA,存在的条件：,(1),高盐：,NaCl2,Mol/L,MgCl,2,0.7,Mol/L,(2),Pu,Py,相间排列：,(3),在活细胞中如果,m5,C,则无需嘌呤,-,嘧啶相间排列，在生,理盐水的浓度下可产生,Z,型。,(4),在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子,一样，可和磷酸基因结合，使,B-DNA,转变成,Z-DNA,。,(

14、5),某些蛋白质如,Z-DNA,结合蛋白带有正电荷，可使,DNA,周围形成局部的高盐浓度微环境。,(6),负超螺旋的存在,生物学意义,(1),可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类动物病毒的,复,制起始部位,有,d,（,GC,）有交替顺序的存在；,(2),在,SV40,的增强子中有三段,8bp,的,Z-DNA,存在。,(3),原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活,性，小核和繁殖有关。,Z-DNA,抗体以萤光标记后，,显示仅和大核,DNA,结合，而不和小核的,DNA,结合，,说明大核,DNA,有,Z-DNA,的存在，可能和转录有关。,引自,：,.,徐晋麟，徐沁，陈淳。（,2005,）,现代

15、遗传学原理,（第二版）。科学出版社。,DNA,的三级结构,?,所谓,DNA,的三级结构，是指在一二结构基础上的多,聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋,基础上的卷曲,?,三级结构包括,链的扭结,和,超螺旋,或者是单链形成的,环或是环状,DNA,中的,连环体,?,超螺旋：由于组成,DNA,双螺旋的两条链没有按照理论数,值互相盘绕，从而在分子内产生张力，原子位置发生重,排，分子本身发生扭曲，这种空间结构叫超螺旋。可分,为正超螺旋和负超螺旋，在特殊情况下可以相互转变。,（在拓扑异构酶和溴乙锭的作用下）,?,超螺旋是,DNA,三级结构的一种普遍形式，双螺旋,DNA,的,松开导致形成负超螺旋，而

16、拧紧则导致形成正超螺旋。,超螺旋使,DNA,形成高度致密状态以容纳于有限的空间中，,而且推动着结构的转化以满足功能上的需要。,（一）,超螺旋,（,Supercoiling,）,DNA,的三级结构,检测,DNA,三级结构的方法：,密度梯度离心,凝胶电泳,电镜观察,引自,：,.,徐晋麟，徐沁，陈淳。（,2005,）,现代遗传学原理,（第二版）。科学出版社。,（二）三链和四链,DNA,?,这些,DNA,分子的结构单元分别是,三碱基体,和,四,碱基体,；,?,这些碱基体通过,Watson-Crick,氢键,配对和,Hoogsteen,氢键,配对相互作用而结合成共平面聚合体：,?,Watson-Cric

17、k,Hoogsteen,三链,DNA,?,基本结构：,?,Py-Pu-Py,构象,(,如,T-A.T,C-G.C,+,),?,Pu-Pu-Py,构象,(,如,A.A-T,G.G-C),H,DNA,第二节,核酸的变性和复性,一,DNA,的变性,DNA,的变性是指在一系列物理化学因素的作用下，,DNA,的分子量不变，二级结构中的氢键遭到破坏，,DNA,的双螺旋结构部分解体，或维系,DNA,分子二级结构的氢,键全部被破坏，双螺旋解旋分离成,DNA,单链的过程叫做,DNA,的变性（,Denaturation,）。,下列因素可导致,DNA,变性：,?,高温、,?,酸、,?,碱、,?,尿素、甲酰胺：增加碱

18、基在水中的溶解度，从,而减弱碱基的疏水交互作用而造成。,DNA,变性后物理性质发生的变化：,（,1,）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增,加；,（,2,）,提,高,了,对,紫,外,线,的,吸,收,能,力,，,此,称,为,增,色,效,应,（,hyperchromic,effect,）。,?,双链,DNA,的,A260=1.00,（浓度为,50,g/ml,时，对波长,260nm,紫外线的吸收能力）；,?,单链,DNA,的,A260=1.37,；,?,游离碱基或核苷酸的,A260=1.60,。,引自,：,.,徐晋麟，徐沁，陈淳。（,2005,）,现代遗传学原理,（第二版）。科学出版社。,

19、解链温度（,melting,temperature,Tm,）或熔点，,Tm,是,A260,的升高达到极大值一半时的温度。即是变性温,度范围的中点。,影响,Tm,值的因素,外部条件：,如温度和正离子的浓度。,浓度低于,0.4mol/L,，单价阳离子增高,10,倍，,Tm,增加,16.6,内部条件：,GC,含量及分子类型,:,当,GC,的含量上升,1%,，则,Tm,上升,0.4,马默多蒂（,Marmur-Doty,）关系式：,Tm,=,69.3+0.41(G,+C)%,，,或,GC%=,（,Tm-69.3,）,2.44,二,DNA,的复性,热变性的,DNA,缓慢冷却，已分开的互补链按原有碱基排,列

20、顺序借助于氢键重新配对结合，致使,DNA,分子的许,多,天,然,性,状,得,以,恢,复,的,特,性,，,称,为,DNA,的,复,性,（,Renaturation,），也称退火,(annealing),。,DNA,的复性对片段有两个要求：,(1),互补顺序的碰撞和排列；,(2),碱基的正确配对和氢键的形成。,影响复性反应的因素,(1),DNA,片段的大小；,(2),DNA,的浓度；,(3),DNA,复杂性,;,(4),温度：最佳复性温度一般比,Tm,低,25,?,C,。,(5),盐的浓度：,复性时要求盐的浓度达到足够高,;,为什么,？,三,核酸分子杂交：,?,分子杂交,(,简称杂交,hybrid

21、ization),是核,酸研究中一项最基本的实验技术。,?,其基本原理就是应用核酸分子的变性,和复性的性质,使来源不同的,DNA(,或,RNA),片段,按碱基互补关系形成杂交双,链分子,(heteroduplex),。,?,杂交双链可以在,DNA,与,DNA,链之间,也,可在,RNA,与,DNA,链之间形成。,常用的分子杂交方法,?,一,.,原位分子杂交（,in,situ,hybridization,）,?,二,.,斑点杂交（,dot,blotting,）,?,三,.,Southern,blot,?,四,.,Northern,hybridization,?,五,.,Western,blotti

22、ng,?,六,.,电镜观察,?,(1),异源双链定位法（,Heferoduplex,mapping,）,?,(2),R-,环定位法（,R-loop,mapping,）,探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物,素等标记的短片段特异,DNA,或,RNA,顺序,核酸分子杂交作为一项基本技术,已应用于核酸结,构与功能研究的各个方面。在医学上,目前已用,于多种遗传性疾病的基因诊断,(gene,diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领,域中,其成果大大促进了现代医学的进步和发展。,Quiz,?,以下,DNA,（只写了一条链）中，解链温度最,高的是：,A.,TTCAAGAGACTT,B.,TCATCAGTTACGTC,C.,GGACCTCTCAGG,D.,CGTAGAGAGTCC,Quiz,?,以下有关,DNA,变性的叙述，正确的是：,A.,是磷酸二酯键的断裂,B.,可由温度的降低而引起,C.,涉及氢键的断裂,D.,涉及,DNA,双螺旋的解开,Quiz,?,下列有关,DNA,变性与复性的叙述，正确的是：,A.,复性后的,DNA,不可能再变性,B.,热变性的,DNA,的迅速降温过程称作退火,C.,热变性,DNA,迅速冷却到,4,可复性,D.,热变性的,DNA,经缓慢冷却可复性,