分子医学技能ppt课件-分子医学技能-实验二.pptx

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1、实验二 PCR检测乙肝病毒PCR分析apoB基因多态性,PCR实验结果图,乙肝病毒PCR实验操作,apoB基因PCR多态性分析,血清样本处理（模板的制备）,PCR检测乙肝病毒,PCR反应上机,口腔细胞总DNA（模板）,apoB基因PCR实验操作,PCR反应上机,实验安排,PCR基本原理及相关知识,The Polymerase Chain Reaction,Sometimes called molecular photocopying,the polymerase chain reaction(PCR)is a fast and inexpensive technique used to amp

2、lify,or make many copies of,small segments of DNA.The technology empowers scientists to undergo a number of processes,from DNA fingerprinting to mapping the human genome.In 1983,Kary Mullis invented the PCR.The process is an invaluable tool to todays molecular biologists and biotechnology corporatio

3、ns.,Kary B.Mullis,As he wrote later in Scientific American:Beginning with a single molecule of the genetic material DNA,the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon.The reaction is easy to execute.It requires no more than a test tube,a few simple reagents and a source of heat.,

4、(1944-),The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method（1/2 of the prize）,3 step and 30 cycles for PCR,Step 1.Denaturation,Step 2.Anneal,Step 3.Extend,30 cycles,create over a billion copies of the sequence,Step 1.Denaturation（变性）,The reaction is first

5、heated to denature(separate)the sides of the double-stranded DNA,Temperature:95 degrees Celsius,Step 2.Anneal（退火）,then cooled to allow the primers to find and bind to their complementary sequences on the separated strands.,Temperature:55 degrees Celsius,Step 3.Extend（延伸）,the polymerase to extend the

6、 primers into new complementary strands.,Temperature:75 degrees Celsius,Repeat the Cycles,Repeated heating and cooling cycles multiply the target DNA exponentially,since each new double strand separates to become two templates for further synthesis.,This process can then be repeated up to 30 times t

7、o create over a billion copies of the sequence.,1个循环后的结果,第2个循环后的结果,模版,第1次的产物,第2次的产物,A,A,B,B,C,D,第3个循环后的结果,第3次的产物,第4个循环后的结果,第4次的产物,1A，1B，2C，2D，2E,A,B,2C,2D,2E,1A，1B，3C，3D，6（22+2）E,A,B,3C,3D,6E,第N个循环后的结果,第N次的产物,1A，1B，（N-1）C，（N-1）D，(2n-2+2)E,(2n-2+2)E,A,B,N-1C,N-1D,Components for PCR Reaction,Template(

8、dsDNA)Primers(TWO short DNA:15-30 nucleotides in length.Longer primers provide higher specificity)P22Taq polymerase（Thermus aquaticus）dNTP Mix(dATP,dGTP,dTTP,dCTP)Reaction Buffer(including Mg2+),10PCR反应缓冲液（buffer）：已作成商品化的产品，它包括：250500mmol/L KCl；100500mmol/L Tris-HAC（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影

9、响很大，一般浓度为1.52.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整）；0.1%明胶或牛血清白蛋白,影响PCR的主要因素 PCR反应体系的各个组分模板的质量、引物的设计、Taq酶的活性 PCR循环的温度与时间预变性、变性、退火、延伸 PCR循环的次数和平台效应 操作环境避免污染,一般PCR实验设计：,样品反应不同的退火温度梯度不同的Mg2浓度不同的模板浓度阴性对照反应阳性对照反应,PCR方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。,二、PCR试剂盒检测HBV DNA 实验操作及注意事项,

10、HBV检测试剂盒介绍,构成：DNA提取液检测反应管（PCR反应体系，上样buffer，石蜡油）阳性模板设计：反应管中有针对HBV的特异性引物，若出现与阳性对照相同的结果，则说明待测样品中含有HBV,PCR实验具体操作,1、待测血清中DNA简单制备,待测血清40ml+40ml DNA 提取液，混匀 沸水浴10min，10000rpm5min,样品模板（用做检测）,无菌水40ml+40ml DNA 提取液沸水浴10min，10000rpm5min上清,空白模板（做阴性反应）,上清,实验分组,阳性反应1个,阴性反应1个,样品检测反应4个,阳性模板2ul,空白模板2ul,样品模板2ul,混匀，6000

11、rpm5s，上PCR仪,933min 预变性94，30s55，30s72，30s72保温5min,30个循环,PCR反应程序：,三、PCR检测人apoB基因多态性分析PCR实验操作及注意事项,实验目的及预期结果,目的：检测来自不同样本的基因多样性检测技术：apoB基因的PCR预期结果：琼脂糖电泳条带的差异,apoB多态性分析的基本实验过程,来源不同的待测样本,PCR扩增目的基因,琼脂糖电泳结果比较分析,实验主要步骤,apoB基因 PCR，1人1份分装PCR反应液每份21ul（包括：Taq，引物一对，反应缓冲液，dNTP）加入模板4ul（口腔细胞基因组DNA）混匀，离心上PCR仪,PCR程序：,94 5min（预变性）94 1min（变性）60 4min（退火+延伸）60 5min（续延伸）,30个循环,HBV-PCR反应结果预测,