黑麂Ⅱ类MHC DQA基因第二外显子扩增及序列分析毕业论文.doc

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1、黑麂类MHC DQA基因第二外显子扩增及序列分析 摘 要：主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因在机体对病原体免疫方面的联系已经得到越来越多的理论支持，特别是其类的DQ, DR基因，其多态性水平在一定程度上衡量着种群的进化潜力。作为一种功能基因遗传标记，其在非模式物种自然种群中的运用越来越多。黑麂(Muntiacus crinifrons)为中国特有的濒危鹿科动物，其野生种群分布范围和数量正逐步缩小。本文扩增了51个黑麂样品的MHC-DQA 第二外显子部分序列，结果得到3个等位基因，彼此之间的核苷酸差异从7到20个（氨基酸差异从4到

2、14个）。没有一个个体获得两个以上等位基因，这说明这些序列可能来自单座位。 抗原结合位点(antigen-binding site ABS）上的非同义替代（dN=0.1560.059）显著大于其同义替代率(dS=0.0120.011)，这暗示着DQA基因曾遭受正选择作用。关键词：黑麂；鹿科；MHC； DQA； 序列分析The Study of MHC DQA exon 2 amplification and sequence analysis in the Muntiacus crinifrons Abstract: The major histocompatibility complex (

3、MHC) has gained the more and more theoretical evidences of the relevance in pathogen resistance. Particularly the DQ, DR genes, which the level of polymorphism indicated the potential evolutionary ability to some extent. As a genetic marker of functional gene, it used a lot in non-model species in n

4、atural populations. The distribution of the wild populations of Black Muntjac (Muntiacus crinifrons), an endangered species endemic to China, is very narrow and its number is decreasing. In this study, we amplified partial MHC class II DQA exon 2 sequences from M. crinifrons. As a result, three alle

5、les were detected in 51 investigated samples, which differ from each other by sever to 20 nucleotide substitutions (four to 14 amino acid substitutions). No a single individual obtained more than two alleles, which suggests these sequences may be from a single locus. A significantly higher rate of n

6、on-synonymouse substitutions (dN=01560.059) than synonymous substitutions (dS=0.0120.011) in antigen-binding site (ABS) codons indicated positive selection in the DQA locus.Key words: Muntiacus crinifrons； Cervidae； MHC ； DQA；sequence analysis1. 引 言:黑麂(Muntiacus crinifrons),属偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cerv

7、idae)麂属(Muntiacus)，为我国特有动物，是典型的亚热带山地森林动物。在我国被列为国家一级保护动物，在濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)和国际自然与自然资源保护联盟(IUCN)名录中分别被列入附录和易危(VU)级，被公认为目前世界上最珍稀的鹿科动物之一。黑麂现仅分布于皖南、浙西以及与之接壤的江西和福建的局部山区，野生种群数量十分稀少（盛和林，1987）。利用中性分子标记对该物种野生3个种群的遗传结构分析结果发现，历史上，黑麂种群经历了明显的瓶颈效应，遂昌种群与黄山以及天目山种群之间已经发生了显著的遗传分化，种群间的基因流受阻（Wu et al., 2006, 2007）。

8、合肥野生动物园内的黑麂圈养种群始于1987年，1989年获得圈养条件下的成功繁殖，种群数量最多时近50头（包括从该园向其它地区的输出个体），遗传分析结果表明，该种群遗传多样性远远低于野生种群，建群个体对后代的遗传贡献存在很大差异，等位基因频率出现严重偏移(WuFang, 2005；Ni et al, 2009)。近年来该圈养种群受多种疾病困扰，数量明显下降，出现了明显的衰退迹象。 主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC)是脊椎动物体内与免疫应答密切相关的一类多基因家族（Klein 1986）。MHC类分子负责监视细胞外环境，主要向 C

9、D 4 + T 细胞提呈外源性抗原（Germain and Margulies, 1993）。其中由第二外显子编码的特别是抗原结合位点（ABS），往往因其直接参与呈递抗原而被赋予一定的选择优势从而表现出高度的多态性（Racioppi et al.,1991；Apaniuset al. 1997; Hedrick and Kim 2000; Hughes and Yeager 1998）。通常认为，MHC基因多态性越高，机体抵御病原体和寄生虫感染的能力就愈强，因此，MHC基因的高度多态性，赋予脊椎动物应对复杂内外环境的进化潜力（PottsSlev 1995）。相比中性分子标记，保护遗传学家对MH

10、C的研究结果更为关注，特别是其可能与个体适合度、种群存活力等重要的生物学属性密切相关，只有通过研究受自然选择作用的遗传变异才能真正理解目标物种的适应进化过程（Hedrick 2001）。这并不意味着MHC基因可以替代中性标记，但越来越多的学者认为MHC基因是迄今阐述脊椎动物适应性进化的最佳候选标记（Sommer, 2005）。目前，对MHC的研究又大多集中在普遍具有多态性的DRB基因上，对DQA的研究相对较少，且多半是关于模式动物或经济效应高的物种。目前研究的比较透彻的是牛和羊的DQA，共检测出3个牛的DQA座位和2个羊的DQA座位，且都有很高的多态性(Andersson and Rask,

11、1988；Scott et al.；1991)。而关于黑麂的MHC甚至麂亚科的MHC报道都为零，由于评定种群遗传多样性水平对物种保护策略制定的重要性。 本文利用PCR-SSCP、克隆及测序技术，分析了野生种群及圈养的共51个黑麂样品的MHC类DQA第二外显子部分序列，同时也望为研究MHC的进化机制提供来自麂亚科的资料。2.材料和方法2.1 实验材料 本文用于检测的黑麂样品共51份，分别采自皖南和浙西山区（39份），采自合肥野生动物园圈养的样品12份，其中包括皮张、血液和肌肉样品。2.2 基因组DNA提取 采用“酚-氯仿法”(Sambrook et al.,2002)，从对黑麂的皮张、血液和肌肉

12、样品提取基因组DNA。2.3 引物设计及PCR扩增两对来自Ballingall et al., 1997，两对自行设计。所有引物信息见Table 1。Table 1. Primers tested in this study引物名引物序列（53）引物来源QA005ATTGTGGC(T,G)GACCAC(G,A)TTGGC Ballingall et al., 1997QA006CACTTACCATTGATAACAGG Ballingall et al.,1997QA007CATACTGTTGGTAGCAGCA Ballingall et al., 1997QA010GAGACTTGGAAAAC

13、ACAGTC Ballingall et al.,1997DQAF1AGGTGGACACTTACCGTTG 自行设计(Ta=56)DQAR1TTGGCTCCTATGGCACAG 自行设计DQAF2CGTTGATAACAGGGGTAAAG自行设计(Ta=55)2.3.1 PCR扩增首先利用引物QA005/QA010（Ta=60）扩增DQA1和DQA2的共享片段，以扩增产物为模板，再用引物对QA005/QA007（Ta=55）和QA005/QA006（Ta=55）分别扩增DQA1和DQA2。反应总体积40l，其中含50-100 ng模板DNA，0.3M引物，2 mM MgCl2 ,0.2 mM d

14、NTP, 10Exbuffer 和 1.5 U ExTaq DNA聚合酶。PCR 反应条件：95 预变性5 min，30 个循环（94变性30 s，适宜的温度下退火30 s，72延伸50 s），所有循环结束后，再72 延伸5 min，8保存。2.3.2 PCR反应体系模板DNA 50-100ng引 物 各0.3MMgCl2 2 mMdNTPs 各0.2 mM10Exbuffer 4lExTaq 1.5 UDdH2O 加至总体系40l2.3.3 PCR反应条件95 5min94 30s60 30s 30个循环72 50s72 5min，8 保存2.4 黑麂DQA基因第二外显子SSCP分型取2.3

15、步骤PCR扩增产物2-3 l，与适量加样缓冲液（(98% formamide, 10 mM EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cyanol)）混合，95变性3min转置冰上冷却，加入8%（(37.5:1)）非变性聚丙烯酰胺凝胶（含10%的甘油），在8，300V电压，于0.5TBE中电泳10-15h（Bio-Rad, DcodeTM Universal Mutation Detection System）。电泳结束后，硝酸银染色，用尼康（Nikon）D80单镜头数码相机在自然光下拍照。将代表不同SSCP带型的条带割胶回收。2.4.1 聚丙烯

16、酰胺凝胶的制备首先配制40的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺（37.5:1），过滤后于4保存丙烯酰胺 38.93g 甲叉丙烯酰胺 1.07g dH2O 至 100.0ml 然后按下列配方配制8的聚丙烯酰胺凝胶： 40Acr-Bis(37.5:1) 8ml 10TBE 2ml TEMED 40l 10% Ammonium persulfate 400l dH2O 至40ml2.4.2 电泳 取PCR纯化产物5L与等体积的点样缓冲液混合后，在bio-rad型DNA扩增仪上于95变性5min后置于冰上，继而用8的聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中，电泳参数为15W,11hour,电泳采用北京均意电泳仪。2.4.3 银染

17、1.配制银染过程所需的固定液、银染液和显色液。 固定液: 冰醋酸 100ml ，dH2O 900ml； 银染液： 硝酸银 1g ，甲醛 1.5ml， dH2O至1000ml； 显影液： 碳酸钠 30g ，硫代硫酸钠 10mg/ml*200l ，dH2O至1000ml。2将带有凝胶的小玻板放入固定液中固定20min。3弃固定液，双蒸水洗3次，每次2分钟。4用染色液染色30min。5弃染色液，双蒸水快速冲洗10-20s。6将胶板置于显影液（3碳酸钠临用前加入甲醛和硫代硫酸钠，使其终浓度分别为甲醛500l/l、硫代硫酸钠2/L）中，于低温（4C）下显影。当条带刚刚显出时换显影液一次。 7弃显影液，用

18、固定液固定5min。 8. 最后用双蒸水清洗2min。干燥。9. 拍照 。2.4.4 PCR重扩增 小刀切取聚丙烯酰胺凝胶中的等位基因片段后，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收纯化后。取5L回收产物作为模板，参照前面的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，把单链DNA变成双链DNA,并用琼脂糖割胶纯化pcr产物备用。2.4.5 筛选阳性克隆 PCR重扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（宝生物工程公司）纯化后，与pMD18T克隆载体（宝生物工程公司）连接，然后转化入大肠杆菌的JM109菌株，37培养过夜。挑取白色单克隆菌落，37培养，PCR检测。2.3.4.6 DNA测序取鉴定确认为阳性克

19、隆的菌液，加入200l LB培养基，37 200rpm振荡培养1-2h，然后送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。2.5 数据统计分析利用Clustal X软件（Thompson et al., 1997）进行序列比对，应用MEGA 4.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis version）（Tamura et al., 2007）将核酸序列翻译成氨基酸序列，并进行核酸位点和氨基酸位点变异检测。利用BLAST引擎从NCBI的GenBank数据中搜索同源序列。根据Brown 等 (1993) 和 Paliakasis 等(1996)的方法推测氨基

20、酸序列中的抗原结合位点，利用MEGA 4.0软件基于Nei 和 Gojobori (1986)的方法，分别计算抗原结合位点（ABS）与非抗原结合位点的同义替换率（synonymous substitution rate, dS）和非同义替换率（non-synonymous substitution rate, dN），并利用Jukes 和 Cantor (1969) 的标准进行校正。利用PAML4.0b（Yang, 1997）软件包中的CODEML程序检测氨基酸水平上的选择压力。该软件根据选择参数（= dN/dS）的大小，推测目标序列是否经受选择压力，如果显著的大于1，则表明存在正选择作用。研

21、究表明，这两个模型较其它模型抗重组干扰的能力更强（Anisimova et al., 2003），因此，本文主要比较M7 和M8 模型对数据组的计算结果。首先，计算出每个模型的最佳似然值，由于最佳似然值差异的2倍（2L） 基本遵循卡方分布，然后根据卡方检验，即似然比检测（likelihood ratio test, LRT）（Yang and Swanson, 2000）本文数据组更适合哪个模型，如果结果显示M8比M7更适合，则表明存在显著的正选择作用。此外，本文使用CODEML软件中的经验贝叶斯路径（empirical Bayes method，BEB）准确检测出哪些位点经历了正选择作用（N

22、ielsen andYang, 1998; Wong et al, 2004）。利用MEGA4.0中的邻接法（Neighbour-joining, NJ）基于Kimura双参数模型构建DQA外显子2等位基因系统发生关系。系统发生分析包括本文分离出的黑麂DQA的3个等位基因，同时从GenBank上下载了驼鹿（Alces alces）DQA(AF458952, AF458953)、梅花鹿DQA1（AY679433AY679444）和DQA2（AY679445AY679460）、牛DQA1（Z48190, Z48191, Z48193-Z48196, D50454）和DQA2（U80866, U80

23、862, U80861, Y07820, Z79515, Z79516, Z79518）、羊DQA1(Z28418, AY230210 M33304, AY230209, AF317617, AY230208)和DQA2(AY312375- AY312379, AY312397)以及猪DQA(EU195154, EU195193, EU195194 EU195198-EU195200)，以棉鼠（Sigmodon hispidus）DQA(AF155914)序列为外群。3. 结 果待添加的隐藏文字内容33.1 引物扩增及SSCP分型利用牛DQA位点组合引物对黑麂基因组DNA进行嵌套扩增，结果发现

24、以QA005和QA010扩增产物为模板时，引物QA005和QA006获得了单一的目标产物，而引物QA005和QA007扩增产物弥散，没有明显的目标条带。对QA005和QA007的扩增产物克隆测序后，设计出两对黑麂DQA位点特异性引物（DQAF1/R1和DQAF2/R1），扩增产物大小分别为254bp 和240bp。利用这两对引物对51个黑麂样品进行PCR扩增，结果均只有36个样品具有稳定单一的产物，而对另外14个样品无明显的目标条带。由于两对引物仅在扩增产物长度上存在差异，而无其它扩增效率上的差别，所以在后续工作中仅对扩增长度为254bp的DQAF1/R1进行分析。利用SSCP技术对该引物的P

25、CR产物进行基因分型，将代表不同SSCP型的条带进行克隆测序，结果从36个黑麂样品中获得3个不同的序列（GenBank accession number：GQ870429-GQ870431），分别命名为Mucr-DQA*01、 Mucr-DQA*02、 Mucr-DQA*03（图1）。没有一个样品同时具有两条以上的序列，绝大部分样品为纯合子，仅两个个体同时具有两条序列。本文所有条序列都得到不同个体或同一个体至少两次独立PCR产物克隆的验证。在所获得的3条DQA序列中，Mucr-DQA01的频率最高(19/36)，其次是Mucr-DQA02（16/36），而Mucr-DQA03仅在一个样品中被检

26、测到。 2 3 4 5 6 7 8 0 0 0 0 0 0 0Mucr-DQA*0101 ALYQSHGPSGQYTQEFDGDELFYVDLGKKETVWRLPMFSQFAGFDPQRALSNIATAKHNLDILTKRSNFTPVIMucr-DQA*0102 E.Q.G.E.Mucr-DQA*0201 DF.R.T.W.N.E.T.L.VM.C.AV + + + + + + + + + + + + +图1 黑麂MHC 类DQA基因第二外显子氨基酸部分序列对位排列，序列上方的数字表示参照人DQ链确定的氨基酸位点的序号。小圆点表示与DQA01序列同样的氨基酸，加号表示参照人DR1(Brown

27、et al, 1993)和DQ(Paliakasis et al, 1996)而确定的ABS位点。Fig.1 Alignment of partial MHC class II DQA exon 2 amino acid sequences of M. crinifrons. The numbers above the aligned sequences refers to the human DQ chain. A dot indicates identical amino acids and a cross indicates putative sites involved in pept

28、ide binding as proposed for the human DRA (Brown et al, 1993) and human DQ molecules (Paliakasis et al, 1996).3.2 序列变异及平衡选择检测本文扩增出的黑麂DQA第二外显子序列去除引物后长219bp（保留了下游引物的两个碱基），经Mega4.0软件翻译成含73氨基酸的多肽序列，没有发现插入（缺失）或终止密码子（图1）。经同源比对后发现与牛、羊以及梅花鹿的DQA2基因第二外显子具有非常高的同源性。共检测到21个核苷酸变异位点（9.6%）和15个氨基酸变异位点（20.5%）。序列间碱基差异

29、范围为7到20个，氨基酸变异范围为4到14个。从表2可以看出，ABS区的dN值明显大于dS， Z检验P值为0.009，而非ABS区域，非同义替换虽然大于同义替换，但Z检验未达到显著水平。利用CODEML程序中的M7和M8模型对本文的数据进行了检测，结果发现模型M8比M7更适合本数据组，表明黑麂DQA基因经历了显著的正选择作用（P=0.024）（表3）。为了更准确的检测正选择位点，进一步利用经验贝叶斯法，共检测到4个氨基酸位点受正选择作用（位点14，61，65，69），其中位点14，61和65位于ABS区。表2 ABS区和非ABS区的非同义替换率（dN）和同义替换率（dS）(标准差)P值为Z检验

30、结果Table 2 Rates (standard error) of non-synonymous (dN) and synonymous (dS) substitutions for ABS and non-ABS. P values are the probability that dN and dS are different using a Z test.非同义替换dN同义替换dSdN/dSP值ABS0.1660.07500110.01215.100.024Non-ABS0.0610.0220.0290.0202.100.314表3 模型M7和M8的似然率检验正选择的结果比较及估计的

31、相关参数Table3 Likelihood ratio test (LRT) comparing the models M7M8 for evidence of positive selection and model parameters estimates.模型Model似然值LnL估计参数Estimate parameters（LRT值）2LM7-404.450p=4.24381 q=0.005009.644M8-399.628p0=0.63378 p=0.00500 q=3.68622 (p1=0.36622) w=11.43774注：自由度df=2，p=0.01、2值为9.21。No

32、te: The 2 value under the significant level of p=0.01 (df=2) is 9.21.4. 讨 论Ballingall 等(1997)利用嵌套引物扩增出牛DQA1和DQA2两个位点，该引物在梅花鹿中也成功的扩增出DQA两个位点（吴华，2004），然而，利用同样的扩增策略，本文仅获得一个DQA位点，根据同源比对，与牛、羊以及梅花鹿的DQA2序列具有高度的同源性。基于黑麂DQA序列设计的两对特异性引物，对全部51个样品中的36个个体具有良好的扩增结果，但另外15个个体没有PCR产物，这种现象暗示该引物在黑麂中可能存在无效等位基因，或者该引物扩增的

33、DQA位点在部分黑麂个体中缺失。如前言中所述，由于DQA位点数目在牛和羊不同个体中存在变异（Ballingall et al. 1997；Hickford et al. 2000），羊11-18%的MHC单倍型缺少DQA1位点（Hickford et al. 2000）。Bryja等（2006）在研究几种野鼠DQA基因多态性时发现了同样的现象。因此，本文黑麂部分个体DQA位点出现无效扩增现象很可能与其它动物DQA位点数目在个体间的变异相似，即黑麂部分个体可能缺少该位点，这尚需要进一步的研究提供更多的证据。 利用本文设计的引物，从36个黑麂个体中共获得3个DQ A外显子2序列，所有个体均不超过两

34、个序列，因此，该引物的扩增产物代表黑麂DQA基因单一位点。经翻译成氨基酸序列后，没有发现终止密码子，而且与牛羊表达位点DQA2具有非常高的同源性（90-91%），因此认为本文扩增的黑麂DQA基因非假基因，而可能是具有功能的DQA位点。Ballingall 等(1997)从193个牛的样品中共获得13个DQA1、5个DQA2和7个DQA3等位基因，Zhou和Hickford（2004）从300个羊的样品中共获得14个DQA1等位基因，Goy等（2009）从267个欧洲野兔样品中检测出10个DQA等位基因，与这些动物DQA基因相比，结合样品数量，黑麂DQA基因具有较高的等位基因多样性，可以肯定随着

35、用于检测的样品数量的增加，黑麂DQA等位基因数量必然会随之增多。正选择检验结果表明， DQA基因外显子2 PBR区dn显著的大于ds（p0.01），暗示黑麂DQA基因曾经历过强烈的正选择作用，这也间接说明本文获得的DQA基因可能为表达的且具有功能的MHC位点。进一步利用经验贝叶斯法检测出共4个氨基酸位点受正选择作用，其中位点氨基酸位点14，61和65位于推测的ABS区，因此，认为正选择作用是维持黑麂DQA基因多态性的重要机制。参考文献:Amills M, Ramirez O, Tomas A, Obexer-Ruff G, Vidal O. 2008. Positive selection o

36、n mammalian MHC-DQ genes revisited from a multispecies perspective J. Genes Immun 9: 651658.Amills M, Sulasa C, Sancheza A, Bertonib G, Zanonib R, Obexer-Ruff G. 2005. Nucleotide sequence and polymorphism of the caprine major histocompatibility complex class II DQA1 (Cahi-DQA1) gene J. Molecular Imm

37、unology 42: 375379.Andersson L, Rask L. 1988. Characterization of the MHC class II region in cattle. The number of DQ genes varies between haplotypesJ. Immunogenetics, 27: 110120.Anisimova M, Nielsen R, Yang Z. 2003. Effect of recombination on the accuracy of the likelihood method for detecting posi

38、tive selection at amino acid sitesJ. Genetics, 164: 1229 1236. Brown JH, Jardetzky TS, Gorga JC, Stern LJ, Urban RG, Strominger JL, and Wiley DC. 1993. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA DR1J. Nature, 364: 3339.Ballingall, K. T., A. Luyai, and D. J. McKe

39、ever. 1997. Analysis of genetic diversity at the DQA loci in African cattle: evidence for a BoLA-DQA3 locusJ. Immunogenetics 46: 237244.Bryja J, Galan M, Charbonnel N, CossonDuplication JF. 2006. Balancing selection and trans-species evolution explain the high levels of polymorphism of the DQA MHC c

40、lass II gene in voles (Arvicolinae)J. Immunogenetics, 58: 191202.Deter J, Bryja J, Chaval Y, Galan M, Henttonen H, Laakkonen J, Voutilainen L, Vapalahti O, Vaheri A, Ribas A, Morand S, Cosson J-F, Charbonnel N. 2008. Association between the DQA MHC class II gene and Puumala virus infection in Myodes

41、 glareolus, the bank voleJ. Infect Genet Evol, 8: 450458.Germain RN, and Margulies DH. 1993. The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentationJ. Annu. Rev. Immunol, 11: 403450.Glass EJ, Oliver RA, Russell GC. 2000. Duplicated DQ haplotypes increase the complexity of restrictio

42、n element usage in cattleJ. Immunol. 165: 134138.Goy BJ, Suchentrunk F, Stuart JEB, Schaschl H. 2009. Evolutionary history of an MHC gene in two leporid species: characterisation of Mhc-DQA in the European brown hare and comparison with the European rabbitJ. Immunogenetics, 61: 131144.Gyllensten U,

43、Sundvall M, Ezcurra I, Erlich HA. 1991. Genetic diversity at class II DRB loci of the primate MHCJ. The Journal of Immunology, 146(12): 4368 4376.Hickford JGH, Ridgway HJ, and Escayg AP. 2000. Evolution of the ovine MHC DQA region J. Anim. Genet, 31: 200205.Hughes AL, Yeager M. 1998. Natural selecti

44、on and the evolutionary history of major histocompatibility complex lociJ. Front. biosci, 3: 509-516.Jukes, TH., and Cantor CR. 1969. Evolution of protein molecules. Pages 21132 in Mammalian Protein Metabolism, H. N. Munro, ed. Academic Press, New York.Klein J. Natural History of the Major Histocomp

45、atibility Complex, 1st edn. 1986. John Wiley, Sons: New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. Klein J, Bontrop RE, Dawkins RL et al. 1990. Nomenclature for the major histocompatibility complexes of different species, a proposalJ. Immunogenetics, 31: 217219. Nei M, Gojobori T. 1986. Simple

46、method for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutionsJ. Mol Biol Evol, 3: 418 426.Nielsen R, Yang Z. 1998. Likelihood models for detecting positively selected amino acid sites and applications to the HIV-1 envelope geneJ. Genetics, 148: 929 936.Ni XW, Meng K, Wu HL, Zhu GP. 2009. Genetic diversity of a captive population of black muntjac revealed by a set of high polymorphsim across-species microsatellites. Animal Biology，59: 273281. Paliakasis, K, Routsias J, Petratos K, Ouzounis C, Kokkinidis M and Papadopoul