马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生毕业论文.doc

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1、学士学位毕业设计（论文）马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生学生姓名： 指导教师： 所在学院：农学院专 业：农 学学 号：20094011302中国大庆2013 年 5 马铃薯茎段愈伤组织诱导及再生 摘要：马铃薯茎段愈伤组织的诱导和再生试验于2012在农学院马铃薯实验室进行。以克新13号、早大白两个品种的马铃薯茎段为材料，研究愈伤组织的诱导及植株再生。试验试剂：MS培养基为基本培养基，可调节的植物激素有6-BA和2,4-D。选择苗龄合适的马铃薯无菌试管苗，切成0.5厘米长，不带腋芽茎段，接种于含不同浓度细胞分裂素6-BA和生长素2,4-D的愈伤组织诱导培养基，进行诱导培养。愈伤组织每2周继代1次。选择

2、生长良好的愈伤组织，接种苗在含有不同浓度6-BA，NAA和GA的培养基中进行茎段愈伤组织分化培养。结果表明：克新13号的最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2mg/L 6-BA +2 mg/L 2,4-D；早大白的最佳愈伤组织诱导培养基为MS+1 mg/L 6-BA+2mg/L 2,4-D。在上述最佳诱导培养基中培养，俩种愈伤组织诱导率分别为62.22%和60.37%，在上述最佳分化培养基中培养，所得的分化率分别为53.81%和57.42%，早大白的分化率高于克新13号的分化率。关键词：马铃薯；愈伤诱导；再生33 Potato Stem Section Callus Induction and Re

3、generation Student :Guo Yongfeng Supervising: Jiang lili Abstract: Potato stem section callus induction and regeneration of this test in 2012 in agronomy courtyard potato laboratory. To g new 13, the early two potato stem section as materials, all kinds of callus induction and regeneration. Test usi

4、ng reagents: MS medium as the basic medium, the movement of the adjustable plant hormones have 6 - BA, 2, 4-d. Select age of seedling and d potato sterile tube seedlings, cut into 0.5 cm long, dont take lateral bud stem section, vaccination to contain different concentration cytokinins 6 - BA and au

5、xin 2, 4-d of callus induction medium, induction training. Callus every 2 weeks successive transfer 1 time. Select growth good callus, vaccination to contain different degrees of cytokinins 6 - BA and NAA and callus induction of GA3 in medium culture. The results showed that: g new number 13 optimum

6、 callus induction medium for MS + 1 mg/L 6 - BA + 2 mg/L 2, 4-d; The early for MS + 2 mg/L 6 - BA + 2 mg/L 2, 4-d. With the above optimum induction medium culture, all kinds of callus induction rate were 62.22% and 60.37% respectively g new, with the optimum induction medium culture, all kinds of di

7、fferentiation rate were53.81% and 57.42% respectively.Key words: Potato; Callus induction; regeneration目 录摘要IABSTRACT II前 言IV1 材料与方法11.1 材料11.2 试验设计11.2.1 基础苗培养11.2.2 培养基配制11.2.2.1 MS培养基11.2.2.2 茎段愈伤组织诱导培养基11.2.2.3 茎段愈伤组织分化培养基21.2.3茎段愈伤组织诱导21.2.4 愈伤组织分化22 结果与分析32.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导率的影响32.2 不同激素配比对愈伤

8、组织分化率的影响42.3 不同基因型对茎段外植体再生的影响53 讨论64 结论6参考文献7致 谢9前 言现代科学指出，植物的生长发育，器官的建成，形状的表现都受激素所调控并且马铃薯品种繁多4，MS培养基不能满足所有试管苗生长的需要，而要保证马铃薯组培苗的外植体成活率，需要有尽可能多的须根和腋芽数以吸收养分和进行光合作用5，因此选择合适的生长调节剂及其浓度以尽可能多的生成须根和腋芽，就成为保证组培苗的外植体成活率和栽植产量的关键6。近年来,随着组织培养技术在马铃薯育种中的广泛应用，组培技术也日趋成熟。成功的组织培养首先依赖于良好的植物受体系统的建立，受体系统的建立则主要依赖于植物组织培养再生环节

9、7-8。因此，建立优化的马铃薯组织培养再生系统,是遗传转化技术在马铃薯育种中应用的关键。而马铃薯不同基因型之间诱导再生的条件存在较大的差异9,因此需要对特定品种,特定材料进行再生系统的筛选，以确定有针对性的最佳培养基。本试验以黑龙江省2个马铃薯主栽品种克新13号、早大白为试材，在组培实验室里模拟了外界自然生态环境，选择苗龄合适的马铃薯无菌试管苗，切成0.5厘米长，不带腋芽茎段，依次接种于含不同浓度的诱导培养基和分化培养基中进行诱导培养以及再生的试验，对马铃薯的最佳再生系统进行了筛选,同时对该环节中起主导作用的植物激素配比进行了研究，优化出了最佳激素配方, 以及优化了马铃薯主栽品种的离体培养再生

10、技术体系，为马铃薯主栽品种的分子改良奠定基础。 1 材料与方法1.1 材料供试材料为克新13号、早大白脱毒试管苗苗，以单芽茎段方式继代培养，由黑龙江八一农垦大学马铃薯研究室提供。1.2 试验设计1.2.1 基础苗培养选取所需品种带有4-5个茎节的脱毒试管苗，在无菌条件下切成单节茎段，转接到盛有50ml经过高压灭菌的固体MS培养基的玻璃方瓶中进行培养。培养温度为2025，每天光照16h，光照强度2000Lx。待试管苗长至单株约45个茎节时，在同样条件下进行扩繁，为试验提供足够的、来源一致的基础苗。1.2.2 培养基配制1.2.2.1 MS培养基在MS母液中添加0.7%的琼脂和30g/L的蔗糖,p

11、H值5.8。配制好的培养基装入250ml 培养瓶内,瓶底直径80mm，每瓶50ml 封口,放入高压灭菌锅内常规灭菌,冷却后在培养室中预培养3-4d，无染菌现象的培养基留下备用。1.2.2.2 茎段愈伤组织诱导培养基在MS培养基基础上添加不同浓度的6-BA和2,4-D，6-BA和2,4-D浓度配比见表1-1。表1-1 茎段愈伤组织诱导培养基添加激素浓度配比培养基编号6-BA浓度（mg/L）2,4-D浓度（mg/L）10.5121132140.5251262270.538139231.2.2.3 茎段愈伤组织分化培养基在MS培养基基础上添加不同浓度的6-BA和NAA。见表1-2。表1-2 6-BA

12、和NAA浓度配比培养基编号6-BA浓度（mg/L）NAA浓度（mg/L）10.5120.523114121.2.3 茎段愈伤组织诱导 在超净工作台上，取不带腋芽长0.5 cm左右的试管苗茎段接种于不同处理的培养基上，每个处理30个茎段，每个处理3次重复，置于自然光照培养室培养。培养2周后统计愈伤组织诱导率，筛选出最优激素组合。1.2.4 愈伤组织分化 待愈伤组织形成后分别转接到不同处理的分化培养基上诱导芽分化，统计芽分化率。 分化率（%）=分化芽数/总外植体数1002 结果与分析2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导率的影响试验结果显示，接种愈伤组织后4-5d，茎段两端切口处便明显膨大，7

13、d后可见到有愈伤组织出现，其后愈伤组织沿维管束向茎段中间生长，15 d左右愈伤组织即可长满茎段表面。由表2-1和表2-2可知，试验所使用的9个激素组合均能诱导克新13号和早大白茎段产生愈伤组织，但诱导率差别很大，克新13号最高可达82.11%，最低仅28.89%；早大白愈伤组织诱导率最高77.17%，最低仅26.88。克新13号在MS+2mg/L 6-BA+2mg/L 2，4-D处理中愈伤组织量最多，诱导率最高，且愈伤组织颜色为绿色，结构致密，表面呈颗粒状，而在其他配比的培养基上所形成的愈伤组织过于疏松，颜色较淡，长势较差，易生根或生长缓慢，数量较少，并有逐渐白化现象。早大白在MS+ 1mg/

14、L6-BA+ 2 mg/L2，4-D处理中愈伤组织量最多，诱导率最高，外植体所形成的愈伤组织才呈哑铃形，愈伤组织颜色为绿色，质地致密，中部和两端膨大均匀；而在其它培养基中形成愈伤时，多数出现整体或中部膨大变粗，两端褐化，有的有生根现象。表2-1 6-BA和2,4-D组合对克新13号茎段愈伤组织诱导的影响编号6-BA（mg/L）2,4-D（mg/L）接种数愈伤数诱导率（%）愈伤状态10.51903134.44 鲜绿色，愈伤较大，结构疏松211893943.82 黄绿色愈伤，愈伤较大，疏松321932931.18 黄白色，愈伤较大，疏松40.52905257.78 黄白色愈伤，结构致密致密5128

15、76473.56 绿色愈伤大，表面有些颗粒状622957882.11 绿色愈伤较小，表面有颗粒状70.53875057.47 绿色愈伤小，致密813904550.00 黄绿色愈伤较大，较疏松923902628.89 绿色愈伤，有白化现象，疏松表2-2 6-BA和2,4-D组合对早大白茎段愈伤组织诱导的影响编号6-BA（mg/L）2,4-D（mg/L）接种数愈伤数诱导率（%）颜色和形状10.51952930.53黄白色愈伤，疏松211913538.46黄绿色愈伤较大，疏松321883944.32黄绿色愈伤，愈伤比较大40.52865766.28绿色愈伤较小，表面有颗粒状512927177.17绿

16、色愈伤小，致密622906875.56绿色愈伤大，表面有些颗粒状70.53905358.89鲜绿色，愈伤较大，疏松813903741.11黄绿色愈伤较大，疏松923932526.88黄白色，愈伤较大，疏松2.2 不同激素配比对愈伤组织分化率的影响选取长势良好的愈伤组织接入不同处理的分化培养基中培养。10d左右愈伤组织表面形成瘤状突起，约30d即可分化出丛生芽。由表2-3可以看出克新13的最高分化率为57.14%，最低仅为13.33%，在MS +1mg/L6-BA +1mg/L NAA处理中的分化率达到最高，同时愈伤组织在27天便可出苗，而处理1中要34天方能出苗。由表2-4可以看出，早大白的最

17、高分化率为50.59%，最低仅为12.12%，在MS +0.5mg/L6-BA +2mg/LNAA处理中的分化率达到最高，同时愈伤组织在26天便可出苗，而处理3中要31天方能出苗，且分化率不佳。表2-3 6-BA和NAA组合对克新13号出苗率的影响编号6-BANAA愈伤数出苗天数出苗数分化率（%）10.5175341013.3320.5286311618.6031191275257.1441280282328.75编号6-BANAA愈伤数出苗天数出苗数出苗率（%）10.516630812.12 20.5285264350.5931176311519.7441272272534.72 表2-4

18、6-BA和NAA组合对早大白出苗率的影响2.3 不同基因型对茎段外植体再生的影响不同基因型的外植体对用于诱导愈伤组织的激素,具有不同的反应和适宜的浓度,由表2-5可以看出本试验选用的两种基因型外植体克新13号和早大白，它们的愈伤组织诱导率分别为62.22%和60.37%，差别并不大，克新13号略高于早大白；而在分化率方面克新13号和早大白分别为53.81%和57.42%，早大白的分化率高于克新13号的分化率，这说明早大白的愈伤组织更易于分化。图2-1与2-2为克新13号和早大白愈伤组织诱导及分化情况。表2-5不同基因型马铃薯愈伤诱导率及分化率对比基因型接种数愈伤数出苗数愈伤诱导率（%）分化率（

19、%）K1372138810162.2253.81早大白8154149160.3757.42 图2-1克新13号和早大白茎段接种3d后的生长情况 图2-2克新13号和早大白茎段愈伤组织分化出苗 4 结论本试验研究不同浓度的植物生长激素6-BA、2,4-D、NAA对马铃薯克新13和早大白茎段愈伤组织的诱导及再生的培养。研究结果显示，克新13号的最适愈伤组织诱导的培养基为MS+2mg/L 6-BA +2 mg/L 2，4-D；早大白为MS+1 mg/L 6-BA+2mg/L 2，4-D。克新13号最适分化培养基为MS+1mg/L 6-BA +1mg/LNAA，早大白最适分化培养基为MS+0.5mg/

20、L 6-BA +2mg/LNAA。试验选用的两种基因型马铃薯克新13号和早大白均能诱导出愈伤组织，但早大白的分化率较高。3 讨论马铃薯的再生包括愈伤组织诱导、芽原基分化、芽的伸长3个阶段,其中芽原基的分化时间很短10。细胞的分化状态在诱愈时即已确定，愈伤诱导和芽原基分化可能同时进行或间隔时间很短。随着愈伤组织的增殖生长,芽原基逐步形成，随后芽原基伸长而形成不定芽。植物激素是植物细胞、组织、器官离体培养中必不可少的物质。再生培养基中激素的组配和浓度是影响再生成功与否的关键。植物生长调节剂是人们利用化学方法合成并筛选出的具有植物激素生理活性的有机化合物11，已成为植物组织培养中培养基的重要组成物质

21、，可有效地改变试管苗生长状态。生长素通过调控蛋白质及核酸的合成,发挥延长细胞长度,促进嫩茎生长的作用12。不同质量浓度的对嫩梢生长作用差异显著13，质量浓度较低时能显著促进嫩梢生长；质量浓度达到一定程度后继续增加，生长则有下降的趋势14。生长素NAA可显著增加试管苗的生根数，使根系粗壮，利于壮苗，也利于试管苗的定植成活率15。细胞分裂素6-BA，可促进细胞分裂与扩大，使茎增粗，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长16。参考文献1司怀军,王蒂,戴朝曦,等.我国马铃薯组织和细胞培养研究进展J.中国马铃薯,2000,4:220-224.2朱明凯,程天庆,高湘玲,等.早熟马铃薯四倍体栽培种花药诱导成株J.园

22、艺学报,1985,12(3):177-180.3双宝,李文芙,李文滨,等.马铃薯优化再生系统的建立j.马铃薯杂志，1995,9(3):134-138.4 Acram T,Prakash K,Prakash L. Study on Callus Induction and Plantlet Regeneration from Stem Explants of Two Potato Varieties. Food product spress，2001，129-131.5Chakraborty S, ChakrabortyN, DattaA. 2000. Plant Hormone Combina

23、tions suitable for Potato STEM cutting Regeneration. PNAS, 97 (7): 3724-3729.6 李凤云，韩丽颖.外源激素对马铃薯脱毒试管苗微繁的影响J. 中国马铃薯，2002，16(4):214-2167 徐传朝，张夏菊等.活性炭对马铃薯试管苗生长和微型薯诱导影响研究J. 中国农业科技导报，2003，5(5): 107-108.8 李文刚.马铃薯脱毒种薯微型化繁育推广体系研究进展J. 哈尔滨工程大学出版社，2003，108-112.9 郝云凤，李可伟等. 脱毒马铃薯快繁培养基的不同支持物J. 马铃薯杂志，2005，19(1): 42

24、-4310 张思鸣，王勇，胡钧铭，王传之. 马铃薯茎尖脱毒与快繁技术应用研究进展. J广东农业科学，2008，(08)：35-37.11温海霞,宿秀丽,周祖新等.鄂北马铃薯品种区域试验总结J.中国种业，2011，(10)：48-49.12宋勇,刘明月,何长征等.湖南春马铃薯品种比较试验J.中国马铃薯，2005，(4)：208-211.13谢俊贤,牛秀群.马铃薯区域试验点评价和选择的定量化研究J.马铃薯杂志，1993，(4)：209-210.14 李凤云,盛万民,于天峰,等.马铃薯不同品种茎段再生系统的筛选J.中国农学通报,2005,21(8):99,100,113.15 蒋敏华,黄先群,李丽,

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